臺灣博碩士論文加值系統

摘要
藥用真菌牛樟芝的子實體為一種獨特的傳統中藥，食藥用的開端是緣自於臺灣的原住民。牛樟芝只寄生於牛樟樹中空的內壁上。近年來為了找尋牛樟芝作為藥材而非法盜砍牛樟樹的事件，使得牛樟樹越來越稀少，牛樟芝的子實體也連帶得越來越困難被發現。在它的釵h醫藥運用中，抗癌是最引人注目的。先前的報告指出將牛樟芝的甲醇萃取物添加到肝癌細胞HepG2、Hep3B的細胞培養環境中時，發現子實體的萃取物會比菌絲萃取物多五倍的癌細胞毒殺效能。以HPLC分析牛樟芝的子實體和菌絲體的甲醇萃取物結果有著顯著的差異，留滯時間在9.9及10.0分鐘之化合物只特異性的存在於子實體當中，這兩個化合物可能為牛樟芝子實體中更具特殊藥效的部分。
固態栽培的牛樟芝因其生理、發育機構不明，所以很難去誘導子實體的產生。初步實驗結果發現，具牛樟芝原基的牛樟椴木塊以增加溼度的方式可以很容易讓其子實體長出，但只有椴木的側方及下方能維持其子實體的結構，上方部位之子實體會明顯自然消退。這跟一般的菇菌差異甚大。其次，在MEA培養基培養的牛樟芝菌絲進行子實體誘導測試時，發現對菌絲機械性傷害有助於子實體形成，但並不具穩定性。若進一步結合機械性傷害及微生物的刺激會以更有效能的方式讓菌絲轉變成類似子實體的結構。這種結構和野生子實體的甲醇萃取物經HPLC分析已具相似的結果。此外溼度的增加及空氣的刺激有助於菌絲的變紅及甲醇萃取物含量的增加。

Abstract

The fruit body of medicinal fungus, Antrodia camphorata (also known as Zang-Zhi), is a unique traditional medicine originally used by native Taiwanese. It only parasites inside the hollow trunk of Cinnamonum kanehirae. This plants have been became less and less due to illegal cut to search Zang-Zhi for medical use in past decades, so it’s more and more difficult to find A. camphorata’s fruit bodies. In many medicinal usages, anti-cancer efficiency is the most noticeable one. By adding the methanolic extracts of A. camphorata into HepG2 or Hep3B cell cultures, previous report showed that the efficiency of inhibiting cell viability of fruit body appeared five fold than mycelia’s. The methanolic extracts of A. camphorata’s fruit body and mycelia had great difference from our HPLC analytical result. The compounds of retention time 9.9 min and 10.0 min are specifically only found in the fruit body. Those two compounds might have special contribution to medicinal treatment.
The culture of A. camphorata on solid medium to induce fruit body formation has been shown difficult since many of its physiological and developmental processes are still unclear. From our primary result, C. kanehirae logs existed with A. camphorata’s primordia could easily grow up by increasing humidity to 95% RH, but only at the peripheral and the bottom sides of trunk can maintain its fruit bodies, the fruit bodies located on the upside part will tend to wild, this phenomena showed somewhat difference from general mushrooms. Culturing A. camphorata’s mycelia in MEA medium to test fructification, we found that the mechanical wounded to the hyphae would contribute to fruit body formation, but found it was unstable. Furthermore, a combination of mechanical wounded and microbial treatments could significantly transform cultural hyphae to a fruit body-like structure and even more stable. The HPLC results showed the methanoic extracts of this structure were similar to the wild fruit bodies. Besides, increasing the humidity and air stimulating could let the mycelial color changed to reddish color and increased the methanolic extracts of mycelia.

目錄

壹、前言----------------------------------------------------1
貳、文獻回顧----------------------------------------------3
一、牛樟----------------------------------------------------3
二、牛樟芝-------------------------------------------------5
(一)、概論--------------------------------------------------5
(二)、生理弁?----------------------------------------------6
1、抗氧化幼?-----------------------------------------------7
2、肝臟防護弁?--------------------------------------------8
3、癌細胞毒殺幼?-----------------------------------------9
4、增進免疫幼?-------------------------------------------10
5、抗病毒能力---------------------------------------------11
6、殺菌、抗發炎能力------------------------------------12
7、降血醣能力----------------------------------------------13
(三)、培養特性---------------------------------------------14
(四)、菌絲體與子實體成分的比較---------------------16
(五)、安全性-------------------------------------------------18
三、誘導子實體的方式-----------------------------------19
參、研究目的------------------------------------------------23
肆、材料與器材---------------------------------------------24
一、試驗材料------------------------------------------------24
二、器材------------------------------------------------------25
伍、實驗方法 -----------------------------------------------26
一、牛樟椴木(已具原基點)子實體發育之初步實驗--26
二、牛樟芝子實體成長記錄------------------------------26
三、純化牛樟芝的菌種鑑定------------------------------26
四、加速牛樟芝菌絲生長之測試------------------------30
五、伴存菌的篩選與弁鄔妠?-----------------------------30
(一)、伴存菌的純化----------------------------------------30
(二)、伴存菌的弁鄔妠?------------------------------------31
六、平板菌絲的出菇測試----------------------------------32
(一)、牛樟芝培養基的抗雜菌寄生測試-----------------32
(二)、通氣對牛樟芝菌絲體的影響-----------------------33
(三)、刮傷對菌絲體的影響--------------------------------33
(四)、逆境對菌絲體的影響--------------------------------34
七、甲醇萃取物的分析-------------------------------------34

陸、結果與討論 ----------------------------------------------36
一、牛樟段木(已具原基點)子實體發育之初步實驗---36
二、牛樟芝子實體成長記錄 -------------------------------37
三、純化牛樟芝的菌種鑑定 -------------------------------38
四、加速牛樟芝菌絲生長之測試 -------------------------39
五、伴存菌的篩選與弁鄔妠?------------------------------40
六、平板菌絲的出菇測試----------------------------------42
(一)、牛樟芝培養基的抗雜菌寄生測試-----------------42
(二)、通氣對牛樟芝菌絲體的影響-----------------------43
(三)、刮傷對菌絲體的影響 -------------------------------44
(四)、逆境對菌絲體的影響 -------------------------------45
柒、結論 ------------------------------------------------------46
捌、參考文獻 ------------------------------------------------70

圖一、冇樟(1)、牛樟(3)、樟樹(5)果實與其各別之? 切面外形(2、4、6)圖---48
圖二、牛樟於臺灣之分佈圖-------------------------------------------------------------49
圖三、牛樟芝子實體處置於牛樟不同方位所造成的構形上之差異-------------50
圖四、牛樟芝ACI3 以引子ITS1&4 所夾出之片斷，與資料庫比對的結果-----50
圖五、18S 核醣體基因序列中牛樟芝的特殊片斷與其它薄孔菌的比較圖-----51
圖六、添加不同濃度樟油對FI 牛樟芝菌絲生長情形之影響---------------------51
圖七、添加不同濃度樟油對ACI3 牛樟芝菌絲生長情形之影響------------------52
圖八、與牛樟芝伴存微生物的外觀圖------------------------------------------------ 53
圖九、與牛樟芝伴存微生物之革蘭氏染色鏡檢圖----------------------------------53
圖十、fE0209 菌與牛樟芝菌絲同時接種時，對牛樟芝菌絲擴張所造成的差異-------------------------------------------------------------------------------------------------54
圖十一、mE0301 菌熱萃取液對牛樟芝菌絲擴張所產生的影響-----------------54
圖十二、fE0209 菌熱萃取液對牛樟芝菌絲擴張所產生的影響------------------55
圖十三、過濾菌液對ACI3 牛樟芝菌絲擴張所產生的影響----------------------- 55
圖十四、Burkholderia cepacia mE0301 及
Trichophyton mentagrophytes 對峙培養22 天後的結果-------------------------------56
圖十五、牛樟芝培養基的抗雜菌寄生測試------------------------------------------ 56
圖十六、ACI3 菌絲因不同通氣天數而產生的顏色變化---------------------------57
圖十七、FI 菌絲因不同通氣天數而產生的顏色變化-------------------------------57
圖十八、ACI3 菌絲於通氣、不通氣及液態培養狀況下，分別的甲醇萃取物經HPLC 分析之留滯時間15 分鐘化合物含量變化情形--------------------------------58
圖十九、FI 菌絲於通氣、不通氣及液態培養狀況下，分別的甲醇萃取物經HPLC 分析之留滯時間15 分鐘化合物含量變化情形-------------------------------58
圖二十、ACI3 菌絲於通氣、不通氣及液態培養狀況下，分別的甲醇萃取物經HPLC 分析之留滯時間16.1 分鐘化合物含量變化情形-----------------------------59
圖二十一、FI 菌絲於通氣、不通氣及液態培養狀況下，分別的甲醇萃取物經HPLC 分析之留滯時間16.1 分鐘化合物含量變化情形---------------------------- 59
圖二十二、ACI3 菌絲於通氣、不通氣及液態培養狀況下，分別的甲醇萃取物經HPLC分析之留滯時間17.8分鐘化合物含量變化情形---------------------------60
圖二十三、FI 菌絲於通氣、不通氣及液態培養狀況下，分別的甲醇萃取物經HPLC分析之留滯時間17.8分鐘化合物含量變化情形-------------------------------60
圖二十四、經由刮傷所造成ACI3 子實體生長現象--------------------------------- 61
圖二十五、MEA 培養基之牛樟芝菌絲因刮除表面菌絲後，倒置於室溫下自行產生子實體的現象-------------------------------------------------------------------------61
圖二十六、野生牛樟芝子實體的甲醇萃取物HPLC 分析圖譜--------------------62
圖二十七、ACI3 菌絲的甲醇萃取物HPLC 分析圖譜------------------------------ 62
圖二十八、實驗室形成的ACI3 子實體之甲醇萃取物HPLC 分析圖譜----------63
圖二十九、醋酸對牛樟芝菌絲發育造成的影響-------------------------------------63
圖三十、 牛樟芝菌絲經刮傷置理後，因污染不明雜菌而造成菌絲激變的現象----------------------------------------------------------------------------------------------64
圖三十一、刮傷伴隨Burkholderia cepacia mE0301 逆境刺激所造成的牛樟芝菇化結果----------------------------------------------------------------------------------------64
圖三十二、牛樟芝刮傷及逆境處置菇化結果與野生子實體及菌絲體之甲醇萃取物HPLC 分析圖--------------------------------------------------------------------------65

表一、一般菇類培養與催菇時的環境調控方式 ------------------------------------66
表二、牛樟芝子實體外徑成長記錄 ----------------------------------------------------66
表三、ACI3 以引子ITS1&4 夾出之片斷與基因庫比對最相近的30 段序列 ----67
表四、ACI3 以引子NS1&4 夾出之片斷與基因庫比對最相近的30 段序列 -----68
表五、ACI3 以引子NS3&8 夾出之片斷與基因庫比對最相近的30 段序列 -----69

Butler, G. M., and Wood, A. E. (1988). ‘‘Effects of environmental factors on basidiome development in the resupinate polypore Phellinus contiguus.’’ Trans. Br. Mycol. Soc., 90(1), 75-83.
Chang, H. L., Chao, G. R., Chen, C. C., and Mau, J. L. (2001). ‘‘Non-volatile taste components of Agaricus blazei, Antrodia camphorate and Cordyceps militaris mycelia.’’ Food chem., 74, 203-207.
Chang, T. T., and Chou, W. N. (1995). ‘‘Anrodia cinnamomea sp. Nov. on Cinnamomum Kanehirai in Taiwan.’’ Mycol. Res., 99(6), 756-758.
Chen, C. H., and Yang, S.W. (1995). ‘‘New steroid acids from Anrodia cinnamomea a fungal parasite of Cinnamomum micranthum.’’ J. Nat. Prod., 58, 1655-1661.
Cho, Y. S., Kim, J. S., David, E. C., and Cho, B. G.(2003). ‘‘Growth promotion of the edible fungus Pleurotus ostreatus by Fuorescent pseudomonads.’’ FEMS micro. biol. lett., 218, 271-276.
Genshiro, K., and Yonosuke, I. (1982). ‘‘Fruiting-inducing activity of cerebrosides observed with Schizophyllum commune.’’ Biochim. Biophys. Acta., 719, 612-618.
Hideo, H., Naoki, T., and Sawao, M. (1985). ‘‘Isolation and identification of cyclooctasulfur, a fruiting-body inducing substance, produced by Strptomyces albulus TO 447.’’ Agric. biol. chem., 49(1), 101-105.
Hseu, Y. C., Chang, W. C., Hseu, Y. T., Lee, C. Y., Yech, Y. J., Chen, P. C., Chen, J. Y., and Yang, H. L. (2002). ‘‘Protection of oxidative damage by aqueous extract from Antrodia camphorata mycelia in normal human erythrocytes.’’ Life sci., 71, 469-482.
Isao, U., and Tatsuo, I. (1972). ‘‘Metabolism of adenosine 3`,5`-cyclic monophosphate and induction of fruiting bodies in Coprinus macrorhizus.’’ J. bacteriol., 113(3), 1249-1255.
Isao, U., and Tatsuo, I. (1973). ‘‘Purification and identification of the fruiting-inducing substances in Coprinus macrorhizus.’’ J. bacteriol., 113(3), 1240-1248.
Lee, I. H., Huang, R. L., Chen, C. T., Chen, H. C., Hsu, W. C. and Lu, M. K. (2002). ‘‘Antrodia camphorata polysaccharides exhibit anti-hepatitis B virus effects.’’ FEMS micro. biol. lett., 209, 63-67.
Masayuki, A., Kayako, H., Yuhji, O. H., Minoru, Y., Sueharu, H., and Teruhiko, B. (1990) ‘‘Basidifferquinone, a new inducer for fruiting-body formation of a basidiomycetes Favolus arcularius from a Streptomyces strain П. Structure of basidifferquinone.’’ Agric. biol. chem., 54(6), 1447-1452.
Paul, S. (2000). ‘‘Growing gourmet and medicinal mushroom.’’ 3rd Ed. Berkeley, Toronto.
Rainey, P.B. (1991). ‘‘Phenotypic variation of Pseudomonas putida and P. tolaasii affects attachment to Agaricus bisporus mycelium.’’ J. gen. microbiol., 137, 2769-2779.
Sawao, M., Hideo, H., and Naoki, T. (1984). ‘‘Anthranilic acid, as a fruiting body inducing substance in Favolus arcularius, from a strain TA 7 of Actinomycetes.’’ Agric. biol. Chem., 48(6), 1669-1671.
Shigeru, O., and Sonoe, O.Y. (1993). ‘‘Stimulation of Schizophyllum commune fruit bodt formation by inhibitor of membrane function and cell wall synthesis. ’’ Biosici. Biotech. Biochem., 57(8), 1270-1274.
Song, T. Y., and Yen, G. C. (2002). ‘‘Antioxidant Properties of Antrodia camphorata in submerged culture.’’ J. agric. food chem., 50, 3322-3327.
Song, T. Y., and Yen, G. C. (2003). ‘‘Protective effects of fermented filtrate from Antrodia camphorata in submerged culture against CCl4-induced hepatic toxicity in rats.’’ J. agric. food chem., 51, 1571-1577.
Stefano, B., Giovanna, B., Cristiana, S., Carlo, L., Elisabetta, T., Colum, D., Carlo, F., Felicia, D., Fergal, O., and Marco, P. N. (1999). ‘‘Pseudomonads isolated from within fruit bodies of Tuber Borchii are capable of producing biological control or phytostimulatory compounds in pure culture.’’ Symbiosis, 26, 223-236.
Thomas, J. Leonard., and Stanley, D. (1968). ‘‘Chemical induction of haploid fruiting bodies in Schizophyllum commune.’’ PROC. N. A. S., 59, 745-751.
Wu, S. H., Leif, R., and Chang, T. T. (1997). ‘‘Antrodia camphorata (‘‘niu-chang-chih’’), new combination of a medicinal fungus in Taiwan.’’ Bot. Bull. Acad. Sin., 38, 273-275.
Yoshiiyuki, M., Linda, H., Toyofumi, Y., Masaharu, T., Fumio, S., Mineo, S., Akio, M., Shonen, Y., and Kengo, S. (1998). ‘‘A mushroom fruiting body-inducing substance inhibits activities of replicative DNA polymerases.’’ Biochem. Biophys. Res. Commun., 249, 17-22.
Yumi, M. (1999). ‘‘Saponin stimulates fruiting of the edible basidiomycete Pleurotus ostreatus.’’ Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(10), 1840-1842.






王威閔 (2001) 利用細胞核傳送方法進行牛樟芝的擬有性雜交。私立中國文化大學生物科技研究所碩士論文。
水野 卓、川合正允 (1997) 菇類的化學、生物化學。國立編譯館。
江素瑛、郢焜裕、王秋萍、魏逸傑、施睿宏、高尚德、謝慶良 (2002) 樟芝之致基因毒性與抗基因毒性評估。臺灣保健食品協會第二屆第二次年會 大會議程及論文摘要。
宋祖瑩 (2003) 樟芝深層培養液抗氧化及抗腫瘤特性之研究。國立中興大學食品科學系博士論文。
吳少風1 (2002) 地栽香菇出菇階段管理要點。食用菌。2:28。
吳昇原2 (2002) 牛樟抽出物對樟芝生長影響之探討。國立臺灣大學森林學研究所碩士論文。
吳德鵬3 (1995) 樟芝微量成份的研究。國立台灣師範大學化學研究所碩士論文。
沈立言、陳怡欣、林文川 (2001) 牛樟芝菌絲體發酵萃取液對肝臟生理機能之影響。中華民國食品科學技術學會第三十一次會員大會論文摘要。
林文鑫、陳俊憲、陳勁初、呂鋒洲1 (2000) 樟芝液態醱酵萃取物對腫瘤細胞株之毒殺性分析。中華民國食品科學技術學會第三十次會員大會論文摘要。
林文鑫、曾虹萍、陳勁初、陳清農、蔡明憲、楊明芬、陳巧文2 (2001) 大鼠致畸測試－樟芝發酵原液凍乾成品。中華保健食品學會第二屆第一次年會壁報論文摘要。
林素民、白純櫻、陳勁初、林靜晞、張基煌、喬長誠3 (2001) 樟芝菌絲體及子實體脂肪酸及麥角固醇之分析。中華保健食品學會第二屆第一次年會壁報論文摘要。
林讚標4 (1993) 牛樟與冇樟。林業試驗所研究報告季刊。第8卷第一期：11-20。
林讚標5 (1997) 談牛樟與冇樟。牛樟生物學及育林技術研討會論文集。林業叢刊第72號。pp.27-34。
高曉薇 (1992) 臺灣靈芝屬新種樟芝之三萜類成分研究。臺北醫學院天然物醫物研究所碩士論文。
馬良瑩 (2002) 牛樟芝醱酵過濾液對人體肝臟機能與健康狀況之影響。國立中興大學生命科學院碩士論文。
徐敬衡、文榮輝、賴秋梅、翁偉恆 (2000) 利用深層發酵生產樟芝菌絲體及抗菌研究。第十五屆全國技術及職業教育研討會論文集 (農業類：環境組)。pp.23-32.
張中姿、陳俊憲、林文鑫、陳勁初、呂鋒洲1 (2001) 深紅色樟芝菌絲體之甲醇萃取物對肝癌細胞株之研究。中華民國食品科學技術學會第三十一次會員大會論文摘要。
張東柱2 (1998) 木生性多孔菌之鑑定。檢疫防疫植物病原真菌鑑定研討會專刊。pp252-258。
張飛翔3 (1999) 平菇早出菇七法。中國食用菌。18(6)：32。
張益軒4 (2002) 牛樟芝分子生物鑑定系統之研究。國立臺灣大學農業化學研究所碩士論文。
黃事暖、蔣昌鐘、劉葉高、吳用堅、林新暖1 (2000) 袋栽香菇“惊蕈”誘導出菇技術。中國食用菌。19(2)：24。
黃胭? (2001) 樟芝菌絲體深層培養期間其抗氧化性質之探討。國立中興大學食品科學系學士論文。
黃惟敏3 (1999) 樟芝微量成分的研究(П)。靜宜大學應用化學研究所碩士論文。
黃鈴娟4 (2000) 樟芝與姬松茸之抗氧化性質及其多醣組成分析。國立中興大學食品科學系碩士論文。
陳宏文1 (2001) 以回應曲面法探討樟芝高密度發酵並分析相關的成份與機能性。國立交通大學生物技術研究所碩士論文。
陳秀雯、戴金華、謝馥如、傅麒璘、陳炎鍊、陳憶萱、陳勁初2 (2001) 樟芝發酵液凍乾成品之微核及染色體畸變試驗。中華保健食品學會第二屆第一次年會壁報論文摘要。
陳勁初、呂鋒洲3 (2001) 靈芝之王：台灣樟芝。元氣齋出版社有限公司。台灣。
陳建志、陳勁初、陳清農、陶茬ョB曾虹萍、盛莉莎4 (2001) 樟芝菌絲體對B型肝炎病毒表面抗原及e抗原之活性檢測。中華民國食品科學技術學會第三十一次會員大會論文摘要。
陳啟楨、蘇慶華、藍明煌5 (2001) 樟芝固體栽培及生物活性之研究。Fung. Sci. 16(1,2): 65-67。
陳清農、陶茬ョB曾虹萍、盛莉莎、陳勁初6 (2000) 樟芝微量成分分析之研究。中華民國食品科學技術學會第三十次會員大會論文摘要。
陳勁初、林文鑫、陳清農、陶茬ョB黃仕政、陳炎鍊7 (2001) 臺灣特有真菌－樟芝菌絲體之開發。Fung. Sci. 16(1,2): 7-22。
陶捰?(1997) 牛樟母樹林。牛樟生物學及育林技術研討會論文集。林業叢刊第72號。pp.67-73。
程一華 (1994) 樟芝之成份研究。國立臺灣師範大學化學研究所碩士論文。
楊金山1 (1977) 牛樟之組織培養。東海大學生物學研究所。
楊書威2 (1991) 中藥樟菇活性成分之研究。國立臺灣大學醫學院藥學研究所碩士論文。
廖英明 (1998) 菇類中的酗ㄓF~樟芝。農業世界雜誌。176：76-79。
臧穆、蘇慶華 (1990) 我國臺灣產靈芝屬一新種—樟芝。雲南植物研究。12(4):395-396。
劉宗榮、陳清農、林文鑫、盛莉莎、黃仕政、陳勁初1 (2001) 樟芝對Sprague-Dawley大白鼠之連續投藥口服急性毒性。中國保健食品學會第二屆第一次年會壁報論文摘要。
劉俊仁2 (2002) 中草藥抗癌機制研究:(壹):黃芩素及黃芩苷對血管新生作用之影響及其機制探討;(貳):樟芝活性多醣體之生物活性分析及其經由免疫調節抑制腫瘤生長之研究。國立臺灣大學生物化學暨分子生物學研究所博士論文。
劉業經3 (1970) 臺灣重要樹木彩色圖誌。國立中興大學, 臺灣省林務局合作研究報告。
鄭育斌、黃松根、林讚標 (1997) 牛樟四個地區同?#37238;變異分析。牛樟生物學及育林技術研討會論文集。林業叢刊第72號。pp.55-62。
蔡雁暉 (2002) 樟芝深層培養液及其多醣體之抗氧化特性。國立中興大學食品科學系研究所碩士論文。
戴宇昀 (2001) 樟芝菌絲體與子實體對四氯化碳及酒精誘導之慢性及急性肝損傷之保肝弁鉞�估。國立中興大學食品科學研究所碩士論文。
簡秋源、姜宏哲、陳淑貞 (1997) 牛樟菇培養性狀及其三萜類成分分析之研究。牛樟生物學及育林技術研討會論文集。林業叢刊第72號。pp.133-137。
蘇慶華 (2002) 健康的守護神-國寶樟芝。愛克思文化事業有限公司。台灣。
嚴貴榮 (2001) 樟芝對STZ誘發高血糖鼠血糖調節與抗氧化之影響。輔仁大學食品營養學系碩士論文。