特發性肺纖維化 (IPF) 是一種不明原因之下呼吸道慢性發炎及造成間質纖維化的肺部疾病。通常特徵會有肺的上皮細胞損傷，出現肺水腫、免疫細胞的浸潤、纖維母細胞的增生及纖維化的現象。目前研究指出，當細胞受傷時，會釋放出一些刺激訊號，纖維母細胞或表皮細胞等在被刺激後，釋出 IL-1β、間白素-6 (IL-6)、胸腺活化調節趨化因子等因子，最後引起發炎和膠原蛋白堆積造成肺纖維化。研究也發現當肺損傷所誘發之發炎反應，其炎性細胞所釋放之細胞激素會刺激產生大量之一氧化氮 (NO) 而造成組織傷害。此外，也發現發炎反應也會造成哺乳類雷帕黴素受器 (mTOR) 途徑失調，造成纖維細胞的遷移與外滲，使得纖維細胞表現大量的趨化因子受體 (CXCR4)，進而造成大量膠原蛋白沉積於肺部。目前在醫院裡最常利用藥物治療的方法，始終無法長期地改善肺纖維化情形。另外，多種針對抗炎的中草藥逐漸受到重視，牛樟芝為生長於台灣牛樟樹特有種真菌，其發酵萃取液被發現具抗炎、抗氧化力等藥效。研究發現牛樟芝是透過抑制 iNOS、細胞激素及 NF-κB 途徑達到抗發炎反應。近來也發現牛樟芝使 mTOR 表現下降的機制，達到抑制癌細胞生長。本研究想藉由牛樟芝抑制發炎反應且可降低 mTOR 表現，減輕膠原蛋白沉積，來評估其對預防或治療 Bleomycin 所誘導肺纖維化之小鼠的效果。在 Bleomycin 處理後 21 天時，相較於無治療之對照組，牛樟芝治療之肺纖維化小鼠的組別中發現：其體重明顯上升、其呼吸道阻力Penh指標明顯下降、肺泡沖洗液蛋白濃度也受到改變、發炎因子 IL-6在肺組織表現明顯下降、纖維化指標膠原蛋白 Col III 基因表現明顯下降及 mTOR 下游因子 CXCR4 也明顯下降，再者，在預先餵食牛樟芝組別中，發現有增強牛樟芝治療效果，其體重回復更明顯，IL-6、Col III 及 CXCR4 基因表現有更明顯下降趨勢。故此，本研究結果顯示牛樟芝具有預防與治療 Bleomycin 所誘導肺纖維化之小鼠的效果，期望日後可用於預防與治療病人肺纖維化的疾病。

Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF) is a high death rate of severe chronic inflammation and fibrosis gradually caused lung disease. Recent study indicated that when lung cells were injured, the fibroblast cells or epidermal cells was released IL-1b, interleukin -6 (IL-6), and produced a large amount of nitric oxide (NO), induced inflammation, collagen accumulation and oxidative induced injury and lead to pulmonary fibrosis. Recently also found that dysregulation of the mammalian target of rapamycin (mTOR) by inflammation mediated fibrocyte migration and extravasation and induced fibrocyte expression of C-X-C chemokine receptor (CXCR4), finally caused a collagen deposition in the lungs. On the other hand, the Antrodia cinnamomea (A.C.) is endemic fungal growth in Taiwan. Recent studies demonstrated that the fermented A.C. extract have an anti-inflammatory effect through inhibition of NOS, COX-2 and cytokines via the NF-kappa B pathway. Furthermore, filtrate of fermented mycelia from A.C. reduced liver fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats. Taken together, we purpose to assess its impact on the feasibility of treatment of pulmonary fibrosis. To accomplish our goal, we examine of protective effects of A.C. extract in mouse model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. We have successfully established a bleomycin-induced pulmonary fibrosis animal model, and its have significant pathological and morphological features of lung injury after bleomycin instillation. These mice were treated with A.C. extract or PBS for 18 days, at the end of treatment, we found that the body weight have significantly increased, and the pulmonary respiratory function have shown significant improvement, the bronchoalveolar lavages fluid protein concentration were reduced, the inflammatory factor IL-6 expression in lung tissue, fibrosis indicator Col III collagen gene, mTOR downstream factor CXCR4 gene expression were significantly decreased in A.C. extract treated group. In conclusion, we demonstrated that the Antrodia cinnamomea extract significant protects against bleomycin-induce lung injury.

目錄
長庚大學博（碩）士學位論文指導教授推薦書 i
長庚大學博（碩）士學位論文口試委員會審定書 ii
長庚大學博碩士論文著作授權書 iii
誌謝 iv
中文摘要 vi
英文摘要 viii
縮寫表 x
第一章、前言 1
1. 肺纖維化 1
1.1 簡介 1
1.2 特發性肺纖維化 1
1.3 肺纖維化之細胞分子機制 3
1.4 肺纖維化之動物模式 6
1.5 Bleomycin 所誘導之肺纖化及作用機制 7
2. 特發性肺纖維化之治療相關方法 11
3. 牛樟芝 (Antrodia cinnamomea) 13
3.1 牛樟芝簡介 13
3.2 牛樟芝藥理應用 16
第二章、實驗設計 21
1. 研究動機 21
2. 研究目的 21
第三章、材料與方法 23
(A) 研究材料 23
(B) 研究方法 23
1. 動物實驗 23
2. 聚合酶連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction，PCR) 相關實驗 29
3. 統計分析方法 32
第四章、結果 33
1. 評估改良後氣管內低注 Bleomycin 所誘導肺纖維化之動物模式平台。 33
1.1 Bleomycin 所誘導肺纖維化動物之體重、存活率及肺功能指標 Penh 變化。 33
1.2 Bleomycin 所誘導肺纖維化動物之肺組織改變。 33
1.3 利用 RT-PCR 方式觀察小鼠肺組織的 IL-1β 和 IL-6 表現。 35
1.4 利用 Real-time PCR 方式觀察小鼠肺組織之纖維化指標 Col III 基因表現。 36
1.5 以 H & E stain 方式觀察氣管內滴注 PBS 及 Bleomycin 在不同天數小鼠肺組織的變化。 37
2. 探討牛樟芝於 Bleomycin 所誘導肺纖維化之動物的保護效果。 38
2.1 給於牛樟芝治療肺纖維化小鼠之體重變化。 39
2.2 給予牛樟芝治療肺纖維化小鼠之肺功能指標變化。 39
2.3 給予牛樟芝治療肺纖維化小鼠之肺泡沖洗液蛋白濃度變化。 40
2.4 給予牛樟芝治療肺纖維化小鼠動物 ICR 小鼠之肺組織乾溼比。 41
2.5 給予牛樟芝治療肺纖維化小鼠之肺組織以 Real-time PCR 偵測基因表現定量統計圖。 42
2.6 給予牛樟芝治療肺纖維化小鼠之肺組織以 H & E stain 方式評估肺組織改變。 43
3. 評估預先給予牛樟芝治療肺纖維化小鼠。 46
3.1 預先給予牛樟芝預防肺纖維化小鼠之體重變化。 47
3.2 預先給予牛樟芝預防肺纖維化小鼠之肺功能指標 Penh 變化。 47
3.3 預先給予牛樟芝預防肺纖維化小鼠之肺泡沖洗液蛋白濃度變化。 49
3.4 預先給予牛樟芝預防肺纖維化小鼠之肺組織乾溼比。 50
3.5 預先給予牛樟芝預防肺纖維化小鼠之肺組織以Real-time PCR偵測基因表現定量統計圖。 51
3.6 預先給予牛樟芝預防肺纖維化小鼠之肺組織以 H & E stain 方式評估肺組織改變。 52
第五章、討論 56
參考文獻 65

 
圖表目錄
圖一 建立改良之小鼠肺纖維化模式平台。 73
圖二 評估使用改良之氣管內滴注方式注入 Bleomycin 與 PBS 於小鼠肺部後對體重的影響。 74
圖三 評估使用改良之氣管內滴注方式注入 Bleomycin 與 PBS 於小鼠肺部後對存活率的影響。 75
圖四 評估使用改良之氣管內滴注方式注入 Bleomycin 與 PBS 於小鼠肺部後對肺功能指標的影響。 76
圖五 評估使用改良之氣管內滴注方式注入 Bleomycin 與 PBS 於小鼠肺部後對肺組織受損的影響。 77
圖六 以 RT-PCR 評估使用改良之氣管內滴注方式注入 Bleomycin 與 PBS 於小鼠肺部後對肺組織的前發炎因子 IL-1β 基因表現的影響。 78
圖七 以 RT-PCR 評估使用改良之氣管內滴注方式注入 Bleomycin 與 PBS 於小鼠肺部後對肺組織之發炎因子及纖維化指標 IL-6 基因表現的影響。 79
圖八 以 Real-time PCR 評估使用改良之氣管內滴注方式注入 Bleomycin 與 PBS 於小鼠肺部後對肺組織之纖維化指標 Col III 基因表現的影響。 80
圖九 以病理組織化學染色法來評估使用改良之氣管內滴注方式注入 Bleomycin 與 PBS 於小鼠肺部後對肺組織受損的影響。 81
圖十 以體重變化來評估牛樟芝於 BLM 處理後之小鼠的治療影響。 82
圖十一 以肺功能指標 Penh 來評估牛樟芝於 BLM 處理後之小鼠的治療影響。 84
圖十二 以肺泡沖洗液蛋白濃度來評估牛樟芝於 BLM 處理後之小鼠的治療影響。 85
圖十三 以肺組織乾溼比來評估牛樟芝於 BLM 處理後之小鼠的治療影響。 87
圖十四 以 Real-time PCR 評估牛樟芝於 BLM 處理後之小鼠肺組織纖維化指標膠原蛋白 Col III 基因表現的影響。 88
圖十五 以 Real-time PCR 評估牛樟芝於 BLM 處理後之小鼠肺組織發炎因子及纖維化指標 IL-6 基因表現的影響。 89
圖十六 以 Real-time PCR 評估牛樟芝於 BLM 處理後之小鼠肺組織 mTOR 下游指標 CXCR4 基因表現的影響。 90
圖十七 以病理組織化學染色法來評估牛樟芝於 BLM 處理後對受損肺組織的影響。 92
圖十八 給予牛樟芝治療肺纖維化小鼠動物 ICR 小鼠之體重變化。 93
圖十九 以肺功能指標 Penh 來評估牛樟芝於預先或 BLM 處理後之小鼠的治療效果。 96
圖二十 以肺泡沖洗液蛋白濃度來評估牛樟芝於預先或 BLM 處理後之小鼠的治療效果。 98
圖二十一 以乾溼比來評估牛樟芝於預先或 BLM 處理後之小鼠的治療效果。 100
圖二十二 以 Real-time PCR 偵測牛樟芝於預先或 BLM 處理後之小鼠肺組織纖維化指標膠原蛋白 Col III 基因表現的影響。 101
圖二十三 以 Real-time PCR 偵測牛樟芝於預先或 BLM 處理後之小鼠肺組織發炎因子及纖維化指標 IL-6 基因表現的影響。 102
圖二十四 以 Real-time PCR 偵測牛樟芝於預先或 BLM 處理後之小鼠肺組織 mTOR 下游指標 CXCR4 基因表現的影響。 103
圖二十五 以病理組織化學染色法來評估牛樟芝於預先或 BLM 處理後對肺組織的影響。 104

宋祖瑩 (2003). 〈樟芝深層培養液抗氧化及抗腫瘤特性之研究〉. 博士論文，國立中興大學食品科學系，台中.
周佳正, 馮南雄, 林恆毅, 李菊芬 & 賴志堅 (2006). 〈細胞外基質金屬蛋白的表現與肺纖維化〉. Fu-Jen J Med 4, S57-S67.
林志遠 (2005). 〈牛樟芝子實體形成之探討〉. 碩士論文，國立東華大學生物技術研究所，花蓮
徐敬衡, 文榮輝, 賴秋梅 & 翁偉恆 (2000). 〈利用深層發酵生產樟芝菌絲體及抗菌研究〉. 《第十五屆全國技術及職業教育研討會論文集 (農業類：環境組)》.
高曉薇 (1991). 〈台灣靈芝屬新種樟芝之三萜類成分研究〉. 碩士論文，台北醫學運天然物醫學研究所，台北.
陳建甫 (2008). 〈主動誘變轉殖系牛樟芝活性成分分析與其分子層面之研究〉. 碩士論文，朝陽科技大學生化科技研究所，台中.
陳書豪 (2006). 〈探討樟芝的溫度變化對液態發酵與固態發酵生產三萜類與多醣體之影響〉. 碩士論文，國立中央大學化學工程與材料工程研究所，桃園.
黃綉月, 項怡平, 李炳鈺 & 林安伸 (2007). 〈原發性肺部纖維化的治療進展〉. Chang Gung J Pharm 14, 1-4.
楊書威 (1991). 〈中藥樟菇活性成分之研究〉. 碩士論文，國立台灣大學醫學院藥學研究所，台北.
楊新玲 & 許游章 (2007). 〈森林中的紅寶石台灣本土性樟芝〉. 《中國醫訊》 47, 37-39.
劉俊仁 (2003). 〈中草藥抗癌機制研究，第二部分：樟芝活性多醣體之生物活性分析及其經由免疫調節抑制腫瘤生長之研究〉. 博士論文，國立台灣大學生物化學暨分子生物學研究，台北.
簡秋源, 姜宏哲 & 陳淑真 (1997). 〈牛樟菇培養性狀及其三萜類成分分析之研究〉. 《牛樟生物學及育霖技術研討會論文集》 林業叢刊第72號, 頁133-137.
嚴貴榮 (2001). 〈樟芝對STZ又發高血糖鼠血糖調節與抗氧化之影響〉. 碩士論文，輔仁大學食品影養學系，新北市.
Adamson, I. Y. & Bowden, D. H. (1974). The pathogenesis of bloemycin-induced pulmonary fibrosis in mice. Am J Pathol 77, 185-197.
Ala-Kokko, L., Pihlajaniemi, T., Myers, J. C., Kivirikko, K. I. & Savolainen, E. R. (1987). Gene expression of type I, III and IV collagens in hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine in the rat. Biochem J 244, 75-79.
Bowler, R. P., Nicks, M., Warnick, K. & Crapo, J. D. (2002). Role of extracellular superoxide dismutase in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 282, L719-726.
Bringardner, B. D., Baran, C. P., Eubank, T. D. & Marsh, C. B. (2008). The role of inflammation in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis. Antioxid Redox Signal 10, 287-301.
Bruijn, J. A., Roos, A., de Geus, B. & de Heer, E. (1994). Transforming growth factor-beta and the glomerular extracellular matrix in renal pathology. J Lab Clin Med 123, 34-47.
Chang, T. T. & Chou, W. N. (1995). Antrodia cinnamomea sp. nov. on Cinnamomum kanehirai in taiwan. Mycol Res 99, 756-758.
Chang, T. T. & Cou, W. N. (2004). Antrodia cinnamomea reconsidered and A. salmonea sp. nov. on Cunninghamia konishii in Tawan. Bot Bull Acad Sinica 45, 347-352.
Chaudhary, N. I., Schnapp, A. & Park, J. E. (2006). Pharmacologic differentiation of inflammation and fibrosis in the rat bleomycin model. Am J Respir Crit Care Med 173, 769-776.
Chen, C. H., Yang, S. W. & Shen, Y. C. (1995). New steroid acids from Antrodia cinnamomea, a fungal parasite of Cinnamomum micranthum. J Nat Prod 58, 1655-1661.
Chiang, P. C., Lin, S. C., Pan, S. L., Kuo, C. H., Tsai, I. L., Kuo, M. T., Wen, W. C., Chen, P. & Guh, J. H. (2010). Antroquinonol displays anticancer potential against human hepatocellular carcinoma cells: a crucial role of AMPK and mTOR pathways. Biochem Pharmacol 79, 162-171.
Chua, F., Gauldie, J. & Laurent, G. J. (2005). Pulmonary fibrosis: searching for model answers. Am J Respir Cell Mol Biol 33, 9-13.
Crystal, R. G., Bitterman, P. B., Mossman, B., Schwarz, M. I., Sheppard, D., Almasy, L., Chapman, H. A., Friedman, S. L., King, T. E., Jr., Leinwand, L. A., Liotta, L., Martin, G. R., Schwartz, D. A., Schultz, G. S., Wagner, C. R. & Musson, R. A. (2002). Future research directions in idiopathic pulmonary fibrosis: summary of a National Heart, Lung, and Blood Institute working group. Am J Respir Crit Care Med 166, 236-246.
Dai, Y. Y., Chuang, C. H., Tsai, C. C., Sio, H. M., Huang, S. C., Chen, J. C. & Hu, M. L. (2003). The Protection of Anthrodia camphorata against Acute Hepatotoxicity of Alcohol in Rats. Journal of Food and Drug Analysis 11, 177-185.
Deterding, R. R., Havill, A. M., Yano, T., Middleton, S. C., Jacoby, C. R., Shannon, J. M., Simonet, W. S. & Mason, R. J. (1997). Prevention of bleomycin-induced lung injury in rats by keratinocyte growth factor. Proc Assoc Am Physicians 109, 254-268.
Ekins, S., Williams, J. A., Murray, G. I., Burke, M. D., Marchant, N. C., Engeset, J. & Hawksworth, G. M. (1996). Xenobiotic metabolism in rat, dog, and human precision-cut liver slices, freshly isolated hepatocytes, and vitrified precision-cut liver slices. Drug Metab Dispos 24, 990-995.
Gharaee-Kermani, M. & Phan, S. H. (2005). Molecular mechanisms of and possible treatment strategies for idiopathic pulmonary fibrosis. Curr Pharm Des 11, 3943-3971.
Hseu, Y. C., Chang, W. C., Hseu, Y. T., Lee, C. Y., Yech, Y. J., Chen, P. C., Chen, J. Y. & Yang, H. L. (2002). Protection of oxidative damage by aqueous extract from Antrodia camphorata mycelia in normal human erythrocytes. Life Sci 71, 469-482.
Inghilleri, S., Morbini, P., Oggionni, T., Barni, S. & Fenoglio, C. (2006). In situ assessment of oxidant and nitrogenic stress in bleomycin pulmonary fibrosis. Histochem Cell Biol 125, 661-669.
Jang, A. S., Lee, J. U., Choi, I. S., Park, K. O., Lee, J. H., Park, S. W. & Park, C. S. (2004). Expression of nitric oxide synthase, aquaporin 1 and aquaporin 5 in rat after bleomycin inhalation. Intensive Care Med 30, 489-495.
Khalil, N. & Greenberg, A. H. (1991). The role of TGF-beta in pulmonary fibrosis. Ciba Found Symp 157, 194-207.
Kuwano, K., Hagimoto, N., Yoshimi, M., Maeyama, T. & Nakanishi, Y. (2004). Apoptosis Signaling Pathways as Therapeutic Targets in Lung Injury. Letters in Drug Design & Discovery 1, 263-268.
Lee, I. H., Huang, R. L., Chen, C. T., Chen, H. C., Hsu, W. C. & Lu, M. K. (2002). Antrodia camphorata polysaccharides exhibit anti-hepatitis B virus effects. FEMS Microbiol Lett 209, 63-67.
Mehrad, B., Burdick, M. D. & Strieter, R. M. (2009). Fibrocyte CXCR4 regulation as a therapeutic target in pulmonary fibrosis. In Int J Biochem Cell Biol, 2009/05/13 edn, pp. 1708-1718.
Mizuno, T. (1995). Bioactive biomolecules of mushrooms: food function and medicinal effect of mushroom fungi. Food Rev int 11, 7-21.
Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J. & Kolb, M. (2008). The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis? Int J Biochem Cell Biol 40, 362-382.
Polunovsky, V. A., Chen, B., Henke, C., Snover, D., Wendt, C., Ingbar, D. H. & Bitterman, P. B. (1993). Role of mesenchymal cell death in lung remodeling after injury. J Clin Invest 92, 388-397.
Rahman, I. & MacNee, W. (1998). Role of transcription factors in inflammatory lung diseases. Thorax 53, 601-612.
Ryhanen, L., Stenback, F., Ala-Kokko, L. & Savolainen, E. R. (1996). The effect of malotilate on type III and type IV collagen, laminin and fibronectin metabolism in dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis in the rat. J Hepatol 24, 238-245.
Saito, F., Tasaka, S., Inoue, K., Miyamoto, K., Nakano, Y., Ogawa, Y., Yamada, W., Shiraishi, Y., Hasegawa, N., Fujishima, S., Takano, H. & Ishizaka, A. (2008). Role of interleukin-6 in bleomycin-induced lung inflammatory changes in mice. Am J Respir Cell Mol Biol 38, 566-571.
Sato, E., Koyama, S., Masubuchi, T., Takamizawa, A., Kubo, K., Nagai, S. & Izumi, T. (1999). Bleomycin stimulates lung epithelial cells to release neutrophil and monocyte chemotactic activities. Am J Physiol 276, L941-950.
Selman, M. & Pardo, A. (2002). Idiopathic pulmonary fibrosis: an epithelial/fibroblastic cross-talk disorder. Respir Res 3, 3.
Simler, N. R., Howell, D. C., Marshall, R. P., Goldsack, N. R., Hasleton, P. S., Laurent, G. J., Chambers, R. C. & Egan, J. J. (2002). The rapamycin analogue SDZ RAD attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Eur Respir J 19, 1124-1127.
Sleijfer, S. (2001). Bleomycin-induced pneumonitis. Chest 120, 617-624.
Song, T. Y. & Yen, G. C. (2002). Antioxidant properties of Antrodia camphorata in submerged culture. J Agric Food Chem 50, 3322-3327.
Song, T. Y. & Yen, G. C. (2003). Protective effects of fermented filtrate from Antrodia camphorata in submerged culture against CCl4-induced hepatic toxicity in rats. J Agric Food Chem 51, 1571-1577.
Thannickal, V. J., Toews, G. B., White, E. S., Lynch, J. P., 3rd & Martinez, F. J. (2004). Mechanisms of pulmonary fibrosis. Annu Rev Med 55, 395-417.
Tsuburai, T., Suzuki, M., Nagashima, Y., Suzuki, S., Inoue, S., Hasiba, T., Ueda, A., Ikehara, K., Matsuse, T. & Ishigatsubo, Y. (2002). Adenovirus-mediated transfer and overexpression of heme oxygenase 1 cDNA in lung prevents bleomycin-induced pulmonary fibrosis via a Fas-Fas ligand-independent pathway. Hum Gene Ther 13, 1945-1960.
Uhal, B. D. (2003). Epithelial apoptosis in the initiation of lung fibrosis. Eur Respir J Suppl 44, 7s-9s.
Umeda, Y., Marui, T., Matsuno, Y., Shirahashi, K., Iwata, H., Takagi, H., Matsumoto, K., Nakamura, T., Kosugi, A., Mori, Y. & Takemura, H. (2004). Skeletal muscle targeting in vivo electroporation-mediated HGF gene therapy of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. Lab Invest 84, 836-844.
Umezawa, H., Ishizuka, M., Maeda, K. & Takeuchi, T. (1967). Studies on bleomycin. Cancer 20, 891-895.
Umezawa, H., Takeuchi, T., Hori, S., Sawa, T. & Ishizuka, M. (1972). Studies on the mechanism of antitumor effect of bleomycin of squamous cell carcinoma. J Antibiot (Tokyo) 25, 409-420.
Wallach-Dayan, S. B., Izbicki, G., Cohen, P. Y., Gerstl-Golan, R., Fine, A. & Breuer, R. (2006). Bleomycin initiates apoptosis of lung epithelial cells by ROS but not by Fas/FasL pathway. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 290, L790-L796.
Wu, S. H., Ryvarden, L. & Chang, T. T. (1997). Antrodia camphorata ('niu-chang-chih'), new combination of a medicinal fungus in Taiwan. Botanical Bulletin of Academia Sinica 38, 273-275.
Zang, M. & Su, Q. (1990). Ganoderma comphoratum, a new taxon in genus Ganoderma from Taiwan, China. Acta Bot Yunnanica 12, 395-396.