摘要
本論文分為兩部份，分別針對甘藷去氫抗壞血酸還原?與樟芝穀氧還蛋白進行基因選殖、表現、特性分析以及酵素動力學研究。
去氫抗壞血酸還原? (dehydroascorbate reductase, DHAR) 為普遍存在於動植物中之抗氧化酵素，可利用穀胱甘? (glutathione, GSH) 將去氫抗壞血酸還原。本實驗由台農 57 號甘藷 (Ipomoea batatas (L.) Lam) 塊根中選殖出 DHAR 之全長 cDNA，並轉殖至大腸桿菌使其大量表現此酵素。藉由電泳分析，具有活性之 DHAR 為單體 (monomeric form)。分析 DHAR 的特性：加熱至 50 ℃ 時其半衰期約為 10.1 分鐘；以 pH 6.0-11.0 處理 0.5 小時後仍有 78 % 以上之活性，以 0.8 M 咪唑 (imidazole) 處理後仍然具有88 % 的活性。以去氫抗壞血酸 (DHA) 與穀胱甘? (GSH) 之不同受質濃度為變因測出之米氏常數 (Km) 分別為 0.19 mM 與 2.38 mM。
穀氧還蛋白 (glutaredoxin, Grx) 為一耐熱性高之小分子蛋白質，其主要功能為還原過氧化物或 DHA，藉由與 GSH mixed disulfides 作用來還原被氧化的雙硫鍵並抵擋氧化壓力造成的傷害，或使某些酵素 (如 Prx) 的雙硫鍵還原以維持這些酵素活性。本實驗成功自樟芝子實體選殖 Grx 之 cDNA 並以基因重組技術轉殖至大腸桿菌使其大量表現此酵素。藉由 HED assay 可證明 Grx 除本身具有之穀氧還蛋白活性外，亦具有去氫抗壞血酸還原?之活性。當受質為 HED 時，其米氏常數為1.29 mM；當受質為 DHA 時，其米氏常數為 2.03 mM。經由
VII
特性分析可知Grx 在 100 ℃ 時其半衰期為 8.5 分鐘，藉由電泳分析可推知 Grx 在加熱後會形成雙體結構並失去活性。Grx 如同大多數抗氧化酵素般，在鹼性環境下具有較高的活性。將 Grx 以 pH 6.0-10.0 的緩衝溶液處理半小時，其活性仍有 95 % 以上；以 0.8 M imidazole 處理 Grx 時仍有 67 % 以上的活性；以 SDS 作用後無活性；加入 protease 作用後迅速失活。

The study of this thesis falls into two parts. One is the studying of sweet potato dehydroascorbate reductase (DHAR) and the other is the studying of Antrodia camphorata glutaredoxin (Grx).
A cDNA encoding a putative DHAR was cloned from sweet potato. The deduced protein showed high level of sequence homology when aligned with DHARs from other organisms. Functional sweet potato DHAR was overexpressed and purified. The purified enzyme showed an active monomeric form on a 12 % native PAGE. The protein’s half-life of deactivation at 50 ℃ was 10.1 min, and its thermal inactivation rate constant Kd was 6.4 x 10-2 min-1. The enzyme was stable in a broad pH range of 6.0-11.0 in the presence of 0.8 M imidazole. The Km values for DHA and GSH were 0.19 mM and 2.38 mM, respectively.
A cDNA encoding a putative Grx was cloned from Antrodia camphorata. The deduced protein showed high level of sequence homology when aligned with Grxs from other organisms. The recombined Grx was transformed to E.coli and overexpressed. After purified, It showed an active monomeric form on a 10 % native PAGE. The purified enzyme demonstrated that it has both Grx and DHAR activity by HED assay. This protein’s half-life of deactivation at 100 ℃ was 8.5 min. The enzyme was stable in a broad pH range of 6.0-11.0 in the presence of 0.8 M imidazole. When treated with protease, the enzyme was cleaved immediately.

目錄

目錄 I
縮寫表 V
摘要 VI
Abstract VIII
壹、前言 1
一、自由基 1
(一) 自由基的定義 1
(二) 植物體內自由基的來源 2
(三) 環境因子誘導產生自由基 2
(四) 自由基的害處 3
(五) 氧化壓力對蛋白質硫基的修飾 4
二、 植物的抗氧化機制 6
(一) 酵素性防禦系統 6
(二) 非酵素性抗氧化防禦系統 6
(三) DNA修復系統 8
三、物種簡介 9
(一) 甘藷 9
(二) 樟芝 10
四、去氫抗壞血酸還原? (dehydroascorbate reductase) 12
(一) 維生素C (ascorbic acid, AsA) 12
(二) 去氫抗壞血酸還原? (dehydroascorbate reductase, DHAR) 12
五、穀氧還蛋白 (glutaredoxin) 15
(一) 穀胱甘? (Glutathione, GSH) 15
(二) 穀氧還蛋白 (glutaredoxin, Grx) 15
六、研究動機 19
貳、實驗材料 20
一、材料 20
(一) 材料來源 20
(二) 載體 20
(三) 宿主 20
二、培養液 21
三、儀器設備 22
四、實驗耗材 23
(一) 套組 23
(二) 其他耗材 23
五、實驗藥品 24
(一) 酵素 24
(二) 緩衝液 24
(三) 培養基添加物 24
(五) 蛋白質電泳相關藥品 25
(六) 純化相關藥品 25
(七) 活性測試相關藥品 25
(八) 標準品 25
(九) 其他 26
六、引子 27
參、實驗方法 28
一、萃取 mRNA 合成 cDNA 28
(一) 萃取 mRNA 28
(二) 合成 cDNA 29
二、基因選殖 30
(一) 選殖甘藷去氫抗壞血酸還原?基因 30
(二) 選殖樟芝穀氧還蛋白基因 31
(三) DNA 電泳分析 31
(四) 膠體回收與目標DNA純化 ( gel elution ) 32
(五) 勝任細胞之製備 32
(六) 抽取質體 DNA 33
(七) 重組質體之製備 34
三、蛋白質之誘導表現與純化 35
(一) 蛋白質之誘導表現與純化 35
(二) 蛋白質電泳分析 36
(三) 蛋白質透析與濃度測定 37
四、酵素之活性測定 38
(一) 甘藷去氫抗壞血酸還原? (sweet potato DHAR) 38
(二) 樟芝穀氧還蛋白 (AcGrx) 38
五、酵素特性分析 40
(一) 熱穩定性 40
(二) pH 耐受性 40
(三) 經不同濃度 imidazole 處理之影響 41
(四) 經不同濃度 SDS 處理之影響 41
(五) 蛋白質水解酵素 (protease) 之影響 41
(六) 酵素動力學之研究 41
肆、結果與討論 43
實驗一、甘藷去氫抗壞血酸還原?： 43
一、選殖甘藷去氫抗壞血酸還原?之 cDNA 43
(一) 5' RACE 與 3' RACE DHAR cDNA選殖 43
(二) 全長 DHAR cDNA 44
(三) 建構重組質體 DNA 44
二、甘藷去氫抗壞血酸還原?之表現與純化 46
三、甘藷去氫抗壞血酸還原?之特性分析 47
(一) 熱穩定性 47
(二) 經不同濃度 imidazole 處理之影響 47
(三) pH 耐受性 48
(四) 蛋白質水解酵素 (protease) 之影響 48
(五) 酵素動力學之研究 49
四、討論 51
實驗二、樟芝穀氧還蛋白： 53
一、選殖樟芝穀氧還蛋白之 cDNA 53
(一) 5' RACE 與 3' RACE AcGrx cDNA選殖 53
(二) 全長 Grx cDNA 53
(三) 建構重組Grx 54
二、樟芝穀氧還蛋白之表現與純化 55
三、樟芝穀氧還蛋白具其他活性分析 56
(一) 比較三種活性差異 56
(二) 酵素動力學研究 56
四、樟芝穀氧還蛋白之特性分析 58
(一) 熱穩定性 58
(二) pH 耐受性 59
(三) 經不同濃度 imidazole 處理之影響 59
(四) 經不同濃度 SDS 處理之影響 60
(五) 蛋白質水解酵素 (protease) 之影響 60
五、討論 61
伍、參考文獻 63
陸、附圖 68
柒、附表 88
捌、附錄 90

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