臺灣博碩士論文加值系統

　　本研究的目的為探討不同培養時間的樟芝醱酵液對六種腫瘤細胞存活率之影響，以及探討醱酵液中化合物與抗腫瘤功能之關係。
第一部分研究結果顯示醱酵二週後醱酵時間並不影響醱酵液pH 值。菌絲體含量隨著醱酵時間增加而增加，在六週時達到最高點，醱酵濾液固形物(FB)含量則隨著醱酵時間增加而減少。再者，菌絲體乙醇萃取物固形物(EEM)含量隨著醱酵時間增加而增加，在第六週時達到最高點，然後則減少；但是醱酵濾液乙醇萃取物固形物(EEF)含量則隨著醱酵時間增加而減少。菌絲體粗三萜與醱酵液粗三萜含量皆隨著醱酵時間增加而增加。然而，在第一部分研究中雖然發現所有的萃取物對於六種腫瘤細胞的生長均有抑制效果，卻未能找出樣品之醱酵時間與抑制腫瘤細胞功能之間的相關性。
第二部分研究即將樟芝之醱酵濾液及菌絲體中粗三萜萃取出來，分別探討其對腫瘤細胞生長之抑制效果。結果顯示菌絲體粗三萜(TM)對於六種腫瘤細胞生長的抑制效果隨著醱酵時間的增加而增加，但醱酵濾液粗三萜(TF) 對於六種腫瘤細胞生長的抑制效果則不與醱酵時間相關。在本實驗中找出最有效之粗三萜是自培養至第八週之菌絲體萃出之三萜(8 TM)，以及最敏感的癌細胞株為HeLa 。
本研究第三部分實驗乃將醱酵八週的菌絲體利用不同溶劑分離粗三萜分離過程中產出七個區分物，分別為Fc 1 、Fc 2 、Fc 3 、Fc 4 、Fc 5 、Fc 6 及Fc 7 ，其中Fc 1 、Fc 2 、Fc 3 、Fc 4 及Fc 7對於HeLa 細胞的生長均具有抑制效果，並且以Fc7 (即粗三萜)最為有效，其IC50 僅17.52μg/ml 。經由HPLC 分析比對推測菌絲體中所含有之二種成分，分別是Rt 33.54 及Rt 36.20 ，可能是具抗腫瘤活性的相關成分，可以作為樟芝發酵時之指標成分。

The objectives of this research were to study the effects of Antrodia camphorata fermentation broth cultivated for various time periods on the viabilities of six tumor cells, and the compounds in the fermentation broth responsible for the antitumor functions.
This research was carried out in three parts. In the first part of this research, the results showed that cultivation time didn’t affect the pH of the fermentation broth. The mycelium content of the fermentation broth increased with the cultivation time, but reached its maximum in 6 weeks. The solid content of the filtrate of the fermentation broth, on the other hand, decreased with cultivation time. In addition, the solid content of EtOH extract of mycelium (EEM) increased with cultivation time up to 6 weeks, and then decreased; but the solid content of EtOH extracts of filtrate (EEF) decreased with cultivation time. Moreover, the results indicated that the crude triterpenoids in both EEM and EEF increased with cultivation time. All of the extracts inhibited the growth of the six tumor cells investigated in this study, but it was unable to find out the most representative relationship between inhibition of the growth of six tumor cells by all the samples and the cultivation time in this part of the research.
In the second part, the results showed that the effect of inhibition of the growth of six tumor cells by the crude triterpenes of EEM increased with the cultivation time, but the inhibitory effect by the crude triterpenes of EEF didn’t related to the cultivation time. The crude triterpenes extracted from the mycelium cultivated for 8 weeks had the most significant inhibitory effect on the HeLa cells.
In the third part of this research, the mycelium cultivated for 8 weeks was extracted by different solvents to yield 7 fractions, and they were named Fc1, Fc2, Fc3, Fc4, Fc5, Fc6 and Fc7. Among these fractions, Fc1, Fc2, Fc3, Fc4 and Fc7 showed inhibitory effect on the growth of HeLa tumor cell, and Fc7 (Ps. Fc7 was also crude triterpenes.) has the lowest IC50 (17.5 μg/ml). The HPLC analysis indicated that there were two compounds (Rt 33.54 and Rt 36.24 min) existed in the mycelium of A. camphorata were highly correlated to the anti-tumor activity of the fermentation process. These two compounds might be used as marker during fermentation process.

中文摘要 …………………………………………………………………………… i
英文摘要 ………………………………………………………………………… iii
前言 ………………………………………………………………………………… v
壹、文獻整理 ……………………………………………………………………… 1
(一) 癌症 ……………………………………………………………………… 1
(二) 樟芝 ……………………………………………………………………… 3
(三) 三萜類化合物 …………………………………………………………… 5
貳、實驗架構 ……………………………………………………………………… 11
叁、材料與方法 ……………………………………………………………….…… 13
　一、實驗材料　………………………………………………………………… 13
(1) 實驗菌株 ……………………………………………………………… 13
(2) 實驗細胞株 …………………………………………………………… 13
(3) 藥品 …………………………………………………………………… 13
(4) 器材與儀器…………………………………………………………….. 15
　二、實驗方法　………………………………………………………………… 17
(1) 樟芝菌株實驗 …………………………………………………………. 17
I. 培養皿平板培養 ………………………………………………. 17
II. 三角瓶液態培養菌酉元 …………………………………………… 17
III. 三角瓶液態醱酵 …...……………………………………………… 18
IV. 菌絲體乾燥與分離 ...……………………………………………… 18
V. 醱酵濾液之製備 ...……………………………………………… 19
VI. 菌絲體乙醇萃取物之製備 ……………………………………… 19
VII. 醱酵濾液乙醇萃取物之製備 …………………………………… 19
(2) 癌細胞株實驗 ...………………………………………………………… 19
I. 細胞株培養 ………………………………………………………. 19
II. 貼附性細胞之繼代培養 ……………………………………… 20
III. 半貼附半懸浮性細胞之繼代培養 ……………………………… 20
IV. 細胞株之冷凍保存 ……………………………………………… 21
V. 細胞株之解凍活化 ………………………………………………. 21
VI. 細胞計數 …………………………………………………………... 22
VII. 細胞存活率試驗( MTT assay ) ……………………………………. 22
1. 貼附性細胞之細胞存活率試驗 ………………………………… 22
2. 半貼附半懸浮性細胞之細胞存活率試驗 ……………………… 23
(3) 分析方法 ………………………………………………………………... 24
I. pH 值檢測 ………………………………………………………… 24
II. 還原醣測定 ……………………………………………………… 24
III. 多醣類含量分析 …………………………………………………. 24
IV. 粗三萜分離 ………………………………………………………. 25
V. High-performance liquid chromatograph 分析 ………………….. 26
肆、結果與討論 …………………………………………………………………… 28
第一部分 ………………………………………………………………………… 28
(一) 培養時間對樟芝醱酵液各種性質之影響 ……………………………… 28
(1) 培養時間對樟芝醱酵濾液pH 值之影響 ……………………………… 28
(2) 培養時間對樟芝醱酵液菌絲體含量之影響 …………………………… 30
(3) 培養時間對樟芝醱酵濾液固形物含量之影響 ………………………… 32
(4) 培養時間對樟芝醱酵液中菌絲體乙醇萃取物(EEM)固形物含量之影響………………………………………………………………………… 33
(5) 培養時間對樟芝醱酵濾液乙醇萃取物(EEF)固形物含量之影響……… 36
(6) 培養時間對樟芝醱酵濾液總多醣含量之影響 ………………………… 38
(7) 培養時間對樟芝醱酵濾液還原醣含量之影響 ………………………… 40
(8) 培養時間對樟芝醱酵液中粗三萜含量之影響 ………………………… 42
(二) 樟芝醱酵濾液(FB)、醱酵濾液乙醇萃取物(EEF)及菌絲體乙醇萃取物(EEM)對各種腫瘤細胞抑制之探討 …………………………………… 44
(1) 樟芝醱酵濾液、醱酵濾液乙醇萃取物及菌絲體乙醇萃取物對胃癌細胞株(AGS)抑制之探討 ……………………………………………………… 44
(2) 樟芝醱酵濾液、醱酵濾液乙醇萃取物及菌絲體乙醇萃取物對結腸腺癌細胞株(COLO 320 HSR)抑制之探討 …………………………………… 49
(3) 樟芝醱酵濾液、醱酵濾液乙醇萃取物及菌絲體乙醇萃取物對子宮頸上皮癌細胞株(HeLa)抑制之探討 …………………………………………… 54
(4) 樟芝醱酵濾液、醱酵濾液乙醇萃取物及菌絲體乙醇萃取物對肝癌細胞株(Hep3B)抑制之探討 …………………………………………………… 59
(5) 樟芝醱酵濾液、醱酵濾液乙醇萃取物及菌絲體乙醇萃取物對攝護腺癌細胞株(LNCaP. FGC)抑制之探討 ………………………………………… 64
(6) 樟芝醱酵濾液、醱酵濾液乙醇萃取物及菌絲體乙醇萃取物對乳癌細胞株(T-47D)抑制之探討 …………………………………………………… 69
第二部分 ………………………………………………………………………… 79
(一) 樟芝醱酵濾液粗三萜及樟芝菌絲體粗三萜對六種癌細胞生長之抑制現象
(1) 樟芝醱酵濾液粗三萜及樟芝菌絲體粗三萜對胃癌細胞株(AGS)抑制之探討 ………………………………………………………………………… 79
(2) 樟芝醱酵濾液粗三萜及樟芝菌絲體粗三萜對結腸腺癌細胞株(COLO 320 HSR)抑制之探討 ……………………………………………………… 83
(3) 樟芝醱酵濾液粗三萜及樟芝菌絲體粗三萜對子宮頸上皮癌細胞株(HeLa)抑制之探討 …………………………………………………………… 87
(4) 樟芝醱酵濾液粗三萜及樟芝菌絲體粗三萜對肝癌細胞株(Hep3B)抑制之探討 ……………………………………………………………………… 91
(5) 樟芝醱酵濾液粗三萜及樟芝菌絲體粗三萜對攝護腺癌細胞株(LNCaP. FGC)抑制之探討………………………………………………………… 95
(6) 樟芝醱酵液粗三萜及樟芝菌絲體粗三萜對乳癌細胞株(T-47D)抑制之探討 ………………………………………………………………………… 99
第三部分 ………………………………………………………………………… 106
(一) 樟芝菌絲體七種區分物對子宮頸上皮癌細胞株(HeLa)抑制之探討… 106
(二) 利用high-performance liquid chromatograph 分析樟芝醱酵液之成分… 109
(1) 分析條件之探討 ……………………………………………………… 109
(2) 樟芝醱酵濾液(FB) 之high-performance liquid chromatograph 分析… 113
(3) 樟芝醱酵濾液乙醇萃取物(EEF) 之high-performance liquid chromatograph 分析 …………………………………………………… 117
(4) 樟芝菌絲體乙醇萃取物(EEM)之high-performance liquid chromatograph 分析……………………………………………………………………… 121
(5) 樟芝菌絲體粗三萜之high-performance liquid chromatograph 分析… 125
(6) 樟芝醱酵液粗三萜之high-performance liquid chromatograph 分析… 120
(7) 醱酵八週之樟芝菌絲體七種區分物之HPLC 分析實驗……………… 132
伍、結論…………………………………………………………………………… 135
陸、參考文獻………………………………………………………………………137
附錄…………………………………………………………………………………146

1. 王伯徹、黃仁彰 (2002)。靈芝與樟芝之研究與市場面面觀。食品工業 34(5)：3-17。
2. 王秀枝。2002。靈芝成分之研究。台北醫學大學要學院要學研究所碩士論文。
3. 王明宇、劉強、車慶明、林志彬。2000。靈芝三萜類化合物對3種小鼠肝損傷模型的影響。藥學學報 35(5): 326-329。
4. 余昂俗。2000。一枝香之化學成份及其生物活性之研究。私立中國文化大學應用化學研究所碩士論文。
5. 吳德鵬。1995。樟芝微量成分的研究。台灣師範大學化學研究所碩士論文。
6. 宋祖瑩。2003。樟芝深層培養液抗氧化及抗腫瘤特性之研究。國立中興大學食品科學研究所博士論文。
7. 李一宏。1993。樟芝菌絲體之培養及其多醣體抗乙型肝炎病毒活性評估。中國醫藥學院中國藥學研究所博論文。
8. 李心允。2003。以1, 3-β-D-聚葡萄醣為指標培養具調節免疫功能之赤芝醱酵液。國立台灣大學食品科技研究所碩士論文。
9. 李奇翰。2001。靈芝抗癌效果之研究。國立台灣大學醫學院醫事技術學研究所碩士論文。
10. 李宛蓁。2003。樟芝菌絲體培養與生理活性成分生成之研究。私立東海大學化學工程研究所碩士論文。
11. 李炫璋。2002。牛樟芝菌絲體之體內保肝功能評估及其熱水萃物在體外對基質金屬蛋白水解酶活性之影響。國立中興大學食品科學研究所碩士論文。
12. 周政賢。1998。靈芝三萜類天然物之結構及生合成。國立陽明醫學院生物化學研究所碩士論文。
13. 林志杉。2001。靈芝的現代研究。北京醫科大學出版社。
14. 洪淑敏。2000。靈芝促進人類肝癌細胞凋亡之研究。國立台灣大學食品科技研究所碩士論文。
15. 高曉薇。1991。台灣靈芝屬新種樟芝之三萜類成份研究。台北醫學院天然物醫學研究所碩士論文。
16. 張富強。2001。以超臨界流體萃取和分離松杉靈芝成分。私立長庚大學化工暨材料工程研究所碩士論文。
17. 陳信仲。2001。靈芝之三萜類化合物之研究。國立中興大學生物化學研究所碩士論文。
18. 陳清農、高柄煌、楊梅春、陳勁初 (1999)。台灣森林中的紅寶石-樟芝。鄉間小路 1：22。
19. 陳健祺 (2000)。食用菇類在醫藥上的應用。食品工業 32(5)：54-67。
20. 陳清農、許勝傑、陳勁初 (2000)。紅色旋風 勢不可檔─在談台灣樟芝。鄉間小路 5：48-50。
21. 陳勁初、黃仕政 (2000)。菇菌類機能性食品之開發。生物產業 11(3)：164-172。
22. 陳勁初、呂鋒洲 (2001)。靈芝之王：台灣樟芝。P38-58。元氣齋出版社，台北‧台灣。
23. 陳藝文。2002。培養條件對樟芝菌絲體生長與抗氧化成分生成之影響。私立東海大學化學工程研究所碩士論文。
24. 程一華。1994。樟芝之成份研究。國立台灣師範大學化學研究所碩士論文。
25. 黃惟敏。1999。樟芝微量成分的研究(Ⅱ)。私立靜宜大學應用化學研究所碩士論文。
26. 黃惠琴。2001。樟芝菌絲體深層培養之研究。私立東海大學化學工程研究所碩士論文。
27. 楊書威。1990。中藥樟芝活性成分之研究。 臺灣大學藥學研究所碩士論文。
28. 廖仁宏。2003。固態培養生產靈芝菌絲體之研究。私立東海大學化學工程研究所碩士論文。
29. 廖英明。1998。菇類中的許不了~樟芝。農業世界雜誌176：76-79。
30. 簡秋源、姜宏哲、陳淑貞 (1997)。牛樟菇培養性狀及其三帖類成分分析之研究。牛樟生物學及育林技術研討會論文集 林業叢刊 72：133-137。
31. 臧穆、蘇慶華。1990。我國台灣產靈芝屬-新種-樟芝。雲南植物研究12：395-396。
32. 蔡淑瑤。2002。靈芝與柳松菇之抗氧化性質和其對腫瘤細胞之毒性及柳松菇之抗致突變性質。國立中興大學食品科學研究所碩士論文。
33. 賴呈委。2000。文蛤凝集素樣成份之腫瘤細胞凋亡調節作用。國立海洋大學食品科學研究所碩士論文。
34. 賴慶亮譯。水野卓，川合正允原著。1997。菇類的化學、生化學。國立編譯館。
35. 羅俊、林志彬。2002。靈芝三萜類化合物藥理作用研究進展。藥學學報 37(7): 574-578。
36. Buchele B, Simmet T. 2003. Analysis of 12 different pentacyclic triterpenic acids from frankincense in human plasma by high-performance liquid chromatography and photodiode array detection. J Chromatogr B 795(2): 355-362.
37. Buchele B, Zugmaier W, Simmet T. 2003. Analysis of pentacyclic triterpenic acids from frankincense gun and related phytopharmaceuticals by high-performance liquid chromatography. Identification of lupeolic acid, a novel pentacyclic triterpene. J Chromatogr B 791(1-2): 21-30
38. Chang YS, Ku YR, Lin JH, Lu KL, Ho LK. 2001. Analysis of the three lupine type triterpenoids in Helicteres angustifolia by high-performance liquid chromatography. J Pharm Biomed Anal 26(5-6): 849-855.
39. Chen JH, Xia ZH, Tan RX. 2003. High-performance liquid chromatographic analysis of bioactive triterpenes in Perilla frutescens. J Pharm Biomed Anal 32(6): 1175-1179.
40. Cherng IH, Wu DP, Chiang HC. 1996. Triterpenoids from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry 41(1): 263-267.
41. Cheung HY, Ng CW, Hood DJ. 2001. Identification and quantification of base and nucleoside markers in extracts of Ganoderma lucidum, Ganoderma japonicum and Ganoderma capsules by miceller electrokinetic chromatography. J Chromatogr 911(1): 119-126.
42. Chiang HC, Wu DP, Cherng IW, Ueng CH. 1995. A sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry 39(3): 613-616.
43. Chyr R, Shiao MS. 1991. Liquid chromatographic characterization of the triterpenoid patterns in Ganoderma lucidum and related species. J Chromatogr 542(2): 327-336.
44. Connolly JD, Hill RA. 1999. Triterpenoids. Nat Prod Rep 16(2): 221-240.
45. Dai J, Zhao C, Zhang Q, Lin ZL, Zheng R, Yang L. 2001. Taraxastane-type triterpenoids from Saussurea pertrovii. Phytochemistry 58(7): 1107-1111.
46. Fang QH, Tang YJ, Zhong JJ. 2002. Significance of inoculation density control in production of polysaccharide and ganoderic acid by submerged culture of Ganoderma lucidum. Process Biochem 37(12): 1375-1379.
47. Fang QH, Zhong JJ. 2000. Effect of initial pH on production of ganoderic acid and polysaccharide by submerged fermentation of Ganoderma lucidum. Process Biochem 37(7): 769-774.
48. Gonzalez AG, Leon F, Rivera A, Munoz CM, Bermejo J. 1999.Lanostanoid triterpenes from Ganoderma lucidum. J Nat Prod 62(12): 1700-1701.
49. Huhuman DV, Sumner LW. 2002. Metabolic profiling of saponins in Medicago sativa and Medicago truncatula using HPLC coupled to an electrospray ion-trap mass spectrometer. Phytochemistry 59(3): 347-360.
50. Jain MK, Yu BZ, Rogers JM, Smith AE, Boger ETA, Ostrander RL, Rheingold AL. 1995. Specific competitive inhibitor of secreted phospholipase A2 from berries of Schinus terebinthifolius. Phytochemistry 39(3): 537-547.
51. Lee IH, Chen CT, Chen HC, Hsu WC, Lu MK. 2002. Sugar flux in response to carbohydrate-feeding of cultured Antrodia camphoata, a recently described medicinal fungus in Taiwan. J Chin Med 13(1): 21-31.
52. Lee IH, Huang RL, Chen CT, Chen HC, Hsu WC, Lu MK. 2002. Antrodia camphorata polysaccharides exhibit anti-hepatitis B virus effects. FEMS Microbiol Lett 209(1): 63-67.
53. Lin SB, Li CH, Lee SS, Kan LS. 2003. Triterpene-enriched extracts from Ganoderma lucidum inhibit growth of hepatoma cells via suppressing protein kinase C, activating mitogen-activated protein kinases and G2-phase cell cycle arrest. Life Sci 72(21): 2381-2390.
54. Lin WC, Kuo SC, Wu YW. 2001. Effects of 28-day’s repeated oral administration of the fermented extract of mycelia of Antrodia comphorata (CCRC 93032) on rats. J Chin Med 12(4): 293-303.
55. Liu X, Yuan JP, Chung CK, Chen XJ. 2002. Antitumor activity of the sporoderm-broken germinating spores of Ganoderma lucidum. Cancer Lett 182(2): 155-161.
56. Mahato SB, Sen S. 1996. Advances in triterpenoid research, 1990-1994. Phytochemistry 44(7): 1185-1236.
57. Mau JL, Huang PN, Huang SJ, Chen CC. 2004. Antioxidant properties of methanolic extracts from two kinds of Antrodia camphorata mycelia. Food Chem 86(1): 25-31.
58. Shiao MS, Lin LJ, Chen CS. 1989. Determination of stereo- and positional isomers of oxygenated triterpenoids by reversed phase high performance liquid chromatography. J Lipid Res 30(2): 287-291.
59. Tai T, Shingu T, Kikuchi T, Tezuka Y, Akahori Akira. 1995. Isolation of lanostane-type triterpene acids having an acetoxyl group from sclerotia of Poria cocos. Phytochemistry 40(1): 225-231.
60. Tang YJ, Zhong JJ. 2002. Fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid. Enzyme Microb Technol 31(1): 20-28.
61. Tang YJ, Zhong JJ. 2003. Role of oxygen supply in submerged fermentation of Ganoderma lucidum for production of Ganoderma polysaccharide and ganoderic acid. Enzyme Microb Technol 32(3-4): 478-484.
62. Tian Q, Ding X. 2000. Screening for limonoid glucosides in Citrus tangerine (Tanaka) Tseng by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. J Chromatogr A 874(1): 13-19.
63. Turner WB, Aldridge DC. 1983. Fungus Metablolies II. 304-365.
64. Wang GJ, Tseng HW, Chou CJ, Tsai TH, Chen CT, Lu MK. 2003. The vasorelaxation of Antrodia camphorate mycelia: Involvement of endothelial Ca2+-NO-cGMP pathway. Life Sci 73(21): 2769-2783.
65. Wolfender JL, Rodriguez S, Hostettmann K. 1998. Liquid chromatography coupled to mass spectrometry and unclear magnetic resonance spectrosxopy for the screening of plant constituents. J Chromatogr A 794(1-2): 299-316.
66. Wu SH, Ryvaren L, Chang TT. 1997. Antrodia camphorata (“niu-chang-chih”), new combination of a medicinal fungus in Taiwan. Bot Bull Acad Sinica 38(4): 273-275.
67. Wu TS, Shi LS, Kuo SC. 2001. Cytotoxicity of Ganoderma lucidum triterpenes. J Nat Prod 64(8): 1121-1122.
68. Yang FC, Huang HC, Yang MJ. 2003. The influence of environmental conditions on the mycelia growth of Antrodia cinnamomea in submerged cultures. Enzyme Microb Technol 33(4): 395-402.
69. Zuco V, Supino R, Righetti SC, Cleris L, Marchesi E, Carlo GP, Formelli F. 2002. Selective cytotoxicity of betulinic acid on tumor cell lines, but not on normal cells. Cancer Lett 175(1): 17-25.