臺灣博碩士論文加值系統

本研究使用本土光桿菌Photorhabdus luminescens 0805-P5G 以聚合酶連鎖反應（PCR）進行目標基因prtA之擴增，在將目標基因片段與載體pET29b接合，轉型至大腸桿菌Escherichia coli Rosetta中，再以IPTG進行大量誘導，可表現出PrtA目標蛋白約53 kDa，經由核甘酸序列轉譯分析後可推衍出474個胺基酸序列，經由MS/MS分析，部分胺基酸片段與先前由核苷酸序列推衍之胺基酸序列相吻合。將純化後的PrtA蛋白酵素進行生化特性分析，當溫度於50℃、pH值為10.5時，此酵素具有最高的活性，於28-37℃時有較佳的熱穩定性，並在pH 5-9有較好的pH值安定性；而對金屬離子的影響，1 mM之ZnSO4及ZnCl2對失活的PrtA能恢復50%的相對活性，生物檢定結果顯示，轉殖株純化之PrtA蛋白酶經注射後對七齡大蠟蛾具有殺蟲力，LC50為32.70 μg/mL，但對餵食三齡美國及本土小菜蛾致死率卻相當的低。

A prtA gene of Photorhabdus luminescens 0805-P5G was amplified by polymerase chain reaction (PCR)，and cloned into expressed vector pET29b.
Sequence analysis of the prtA gene showed an open reading frame of 1422 bp, encoded a protein of 474 amino acid and had a molecular mass of 53 kDa. The expression plasmid pET29b was transformated into Escherichia coli Rosetta (DE3). The recombinant strain was induced by IPTG to produce PrtA protease. Moreover, the optimal pH and temperature of the purified enzyme were 28-37 ℃ and 5.0-9.0, respectively. LC50 of purified PrtA protease of P. luminescens against 7th instar larvae of Galleria mellonella by injection was 32.7 μg/mL. However, the LC50 of purified PrtA protease of P. luminescens aginst 3rd larvae of Plutella xyllostella per os was not obtained.

目錄

摘要 I
Abstract II
誌謝 III
目錄 IV
圖目錄 VI
表目錄 VII
第ㄧ章 緒論 1
1-1 前言 1
1-2研究目的 3
1-3 研究大綱 3
第二章 文獻回顧 5
2-1 光桿菌簡介 5
2-2 光桿菌與線蟲的關係 5
2-3 光桿菌對磷翅目昆蟲之殺蟲活性 7
2-4 蛋白質分解酵素 7
2-4-1 蛋白質分解酵素的簡介 8
2-4-2 蛋白質分解酵素的分類依據與其命名 9
2-5 光桿菌的蛋白質分解酵素 10
第三章材料方法 11
3-1實驗儀器及菌株之來源與培養 11
3-1-1實驗菌種 11
3-1-2 實驗儀器設備 11
3-1-3 菌株培養 12
3-1-4 菌種保存 13
3-2 Genomic DNA製備 13
3-3聚合酶連鎖反應（PCR） 14
3-4 洋菜膠體電泳(Agarose Gel Electrophoresis)及染色 14
3-5中間質體之構築及轉殖 15
3-6質體DNA (Plasmid DNA)之製備質 15
3-7 限制酶切位處理 ( Restriction enzyme digestion ) 16
3-8 DNA片段回收處理 16
3-9 DNA之接合(Ligation)酵素反應 17
3-10 勝任細胞之製備 17
3-11表現質體之構築與轉殖大腸桿菌DH5α勝任細胞 17
3-12 prtA基因之轉形作用(Transformation) 18
3-13 E. coli Rosetta (pETprtA)表現蛋白質之誘導(Induction) 19
3-14 核酸定序 19
3-15 E. coli Rosetta (pETprtA)細胞萃取液的製備 20
3-16 親合性管柱(Ni-NTA Resin Column)製備及蛋白質純化 20
3-17 蛋白質之胺基酸片段分析(LC-MS/MS) 21
3-18 蛋白質分解酵素之活性分析：偶氮酪蛋白(Azocasein microassay)水解能力之測試 21
3-19 總蛋白質之分析 22
3-20 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(Sodium Dodecylsulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE) 23
3-21 Coomassie Brilliant Blue染色 24
3-22 西方墨點分析法 24
3-23 蛋白質分解酵素膠體酵素活性電泳分析（zymogram） 26
3-24 蛋白特性分析(characterization) 27
3-24-1 pH值對酵素活性之影響 27
3-24-2溫度溫度對酵素活性之影響 28
3-24-3 不同金屬離子對蛋白質分解酵素活性影響 29
3-24-4 蛋白質分解酵素殺蟲活性試驗 29
第四章 結果 31
4-1 聚合酶連鎖反應擴增目標基因 31
4-2 prtA基因中間質體及表現質體之構築 31
4-3 prtA基因表現質體轉殖大腸桿菌DH5α勝任細胞與大腸桿菌Rosetta (DE3) 32
4-4 核酸定序 32
4-5 親合性管柱純化蛋白質 33
4-6胺基酸片段分析(MS/MS) 33
4-7蛋白質分解酵素膠體酵素活性分析zymogram 33
4-8 pET29prtA之西方墨點分析 34
4-9蛋白特性分析 34
4-9-1酵素活性之最適pH值及pH值穩定性 34
4-9-2酵素活性之最適溫度及及溫度穩定性 35
4-9-3金屬離子對酵素之影響 35
4-9-4蛋白質分解酵素殺蟲活性試驗 36
第五章 討論 37
第六章 結論 41
參考文獻 43

圖目錄

圖1.實驗流程圖 49
圖2. 本土光桿菌0805-P5G prtA 基因之選殖與表現載體（pET29b）之構築 50
圖3.利用prtA-F、prtA-R 引子組對本土光桿菌0805-P5G prtA基因進行PCR擴增目標片斷之1%洋菜膠體電泳圖。 51
圖4. 利用限制酶剪切確認本土光桿菌0805-P5G重組質體(pTprtA及pETprtA）prtA 基因之1%洋菜電泳膠體圖。 52
圖5. 重組菌株Escherichia coli Rosetta (pETprtA)的prtA基因之核甘酸序列與推衍之胺基酸序列。 54
圖6. 純化本土光桿菌蛋白酶之His-tag管柱層析圖。 55
圖7. 添加IPTG大量表現重組蛋白以及純化結果之SDS-PAGE圖。 56
圖8. 利用Zymogram與活性染在酪蛋白分析光桿菌0805-P5G蛋白質分解酵素。 57
圖9. 經由His-Tag親合性管柱純化重組菌株Escherichia coli Rosetta(pETprtA蛋白之SDS-PAGE分析圖及西方墨點圖。 58
圖10. 光桿菌經純化之PrtA蛋白分解酵素的最適pH值。 59
圖11. 純化之光桿菌PrtA蛋白分解酵素的最適溫度。 60
圖12. 光桿菌PrtA蛋白分解酵素之pH值穩定性。 61
圖13. 光桿菌PrtA蛋白分解酵素之溫度穩定性。 62


表目錄

表1.用於PCR之prtA基因引子對設計 ……………………………………………….63
表2.金屬離子對光桿菌PrtA蛋白分解酵素之影響 …………………………………….64
表3.本土P.luminescens 0805-P5G PrtA蛋白酵素對鱗翅目昆蟲之LC50 ……………….65

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