臺灣博碩士論文加值系統

牛樟芝（Antrodia camphorata）為台灣特有的一種真菌，生長於本土特有牛樟樹之中空腐朽心材上，其子實體生長速度非常緩慢。本研究的主要目的為，在所收集到的五種樟屬植物中，尋找促使牛樟芝生長之天然物成分。本研究利用添加不同樟屬植物萃取物之液態培養方式，並分別測量牛樟芝菌絲體乾重累積量、菌絲體胞內酵素之代謝能力、蛋白質及碳水化合物含量、捕捉1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH）自由基能力，及利用高效能液相層析儀（HPLC）定性分析菌絲體之三萜類化合物、二維電泳分析菌絲體之蛋白質等電點分佈及分子量表現。由實驗結果顯示，樟樹之水萃取物對菌絲體產量及生長代謝力呈現最佳的促進效果。其萃取物中多醣分離部分，對菌絲體之產率（5.19 g/L），與基礎培養基所得產率（2.88 g/L）相比，有顯著的促進效果（p＜0.01）。其甲醇萃取物在濃度為2 mg/ml下，對DPPH自由基有85.10 %的清除力，且隨培養時間及劑量的增加，清除能力有增強的效果。樟樹之多醣部經酸水解後，以高效陰離子交換層析法分析，其組成含量佔多醣部百分比由高至低分別為mannose （10.964 %）、galN（5.316 %）、glucose（3.195 %）、myo-inositol（2.62 %）、sorbitol（1.912 %）、fucose（1.551 %）、galactose（1.229 %）及fructose（0.072 %）。添加樟樹水萃取物所培養之菌絲體，培養至第七天時，以HPLC分析，經紫外光全光譜掃描，已有三萜類的化合物產生，其含量及種類隨培養時間增加而提高，添加樟樹水萃取液培養21天的菌絲體，進一步與子實體所得之化合物比對，證實菌絲體含有相同的化合物15-Acetyl-dehydrosulphurenic acid。菌絲體蛋白質經二維電泳膠片圖譜分析，添加樟樹萃取物之菌絲體蛋白質，等電點集中於pH 4-7，以基礎培養基培養，則集中於pH 5-8，且比基礎培養基的蛋白質多一個分子量為21.5 KDa的酸性蛋白質。

Antrodia camphorata is an indegenous fungus that parasitic on the inner cavity heart wood of the endemic species Cinnamomum kanehirae Hay. The fruiting body grow extremely slow in the nature. The aim of this research was to investigate the hyphal growth factors of Antrodia camphorata (Niu-Chan-Chi) from natural products of the Cinnamomum Schaeffers (Cinnamomum kanehirae, Cinnamomum micranthum, Cinnamomum osmophloeum, Cinnamomum camphora and Cinnamomum kotoense). The effects of treated with different extracts from Cinnamomum Schaeffers on the biomass, growth-related metabolic activity, protein and total carbohydrate content, scavenging activity on 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH), High-performance liquid chromatography （HPLC）analysis and electrophoresis on the A. camphorata B85 were determined. The results showed that A. camphorata feeding with the water-extract fraction of C. camphora exhibited the highest growth promotion effect on the biomass accumulation at the dosage of 5.19 g/L than that of control (2.88 g/L). The metabolic activity also showed a higher degree than that of control at the significant level of  < 0.01. Likewise, the scavenging activity on DPPH exhibited a dose-dependent manner. At dosage 2 mg/ml of feeding with polysaccharide from C. camphora on mycelia have 85.10 % scavenging activity. The high-performance anion-exchange chromatography (HPAEC) analysis was used to characterize the crude polysaccharide of C. camphora. Compositional analysis showed that the polysaccharide fraction composed of mannose (10.964%), galactosamine (5.316%), glucose (3.195%), myo-inositol (2.62 %), sorbitol (1.912%), fucose (1.551%), galactose (1.229 %) and fructose (0.072 %). The chromatogram of A. camphorata mycelia feeding with C. camphora water-extract showed triterpenoid-signal with prolonged cultivation, the signal gets higher. The triterpenoids, 15-Acetyl- ehydrosulphurenic acid , one of the compounds in fruiting bodies of A. camphorata was also detected in the 21-day-cultured mycelia. Two-dimensional gel electrophoresis of the proteins showed that the spots were mainly localized in the pI range value of 4-7. Whereas, the proteins isolated from basal medium cultured A. camphorata were localized in the pI range value of 5-8.

目錄
頁次
致謝…………………………………………………………………… I
中文摘要……………………………………………………………… II
英文摘要……………………………………………………………… III
目錄…………………………………………………………………… IV
表目錄………………………………………………………………… VII
圖目錄…………………………………………………………………VIII
第一章 緒論
1.1 前言……………………………………………………………… 1
1.2 研究背景與目的……………………………………………………2
第二章 文獻回顧
2.1 牛樟芝生物學特性…………………………………………………3
2.1.1 牛樟芝基源考察及分類地位…………………………………3
2.1.2 牛樟芝的型態特徵…………….…………..…………….….4
2.2 牛樟芝的培養研究……………….………...………………….…5
2.3 牛樟芝成分…………..…………..….………………...………..….6
2.3.1一次代謝物成分……………………….………………………6
2.3.2 二次代謝物成分………………………………….…..……….7
2.3.3 微量元素………………………………………….….………12
2.4 牛樟芝的生理活性物質與藥理研究………………….....………13
2.5 牛樟芝安全性評估……………………………………...…..……14
第三章 實驗材料與配方
3.1 菌株………………………………………………...……………..15
3.2 樟屬植物………………………………………………….………15
3.3 實驗藥品與試劑……………………………………….....………15
3.4 實驗溶液配方………………………………………….....………17
3.5 實驗儀器與設備…………….……………………………………22
第四章 實驗方法
4.1 菌種保存……………………………………………..…...………24
4.1.1 斜面培養基製作…………………………………..…………24
4.1.2 菌種保存…………………………………………..…………25
4.2 固態培養…………………………………………...……..………26
4.3 液態培養……………………………………………...……..……27
4.3.1 液態培養基及培養…………………………………..………27
4.3.2 添加不同萃取物培養………………………………..………27
4.3.2.1 添加萃取物劑量之探討………………………..…….…27
4.3.2.2 樟屬植物萃取物對菌絲體生長影響之篩選…………...28
4.3.2.3樟樹之不同溶劑萃取物對菌絲體生長影響………….....30 4.3.2.4不同培養天數對生長因子影響之追踪……………….…30 4.3.2.5 樟樹水萃取物之分離部對菌絲體生長之影響………...31
4.4 菌絲體測定及分析方法……………………………...……..……34
4.4.1 生物量測定…………………………………………………..34
4.4.2 代謝能力測定………………………………………..………34
4.4.3 碳水化合物含量測定………………………………………..36
4.4.4 多醣體萃取………………………………………………..…36
4.4.5 蛋白質測定………………………………………….…….…37
4.4.5.1 蛋白質萃取法…………………………………………...37
4.4.5.2 蛋白質定量分析…………………..………………….…37
4.4.5.3 電泳分析法…………………..……………………….…38
4.4.5.4 等電電聚焦法…………..……….....…………...…….…39
4.4.5.5 二維電泳………...………………………….…….…..…40
4.4.5.6 銀染法……………..………...…………………….….…41
4.5 菌絲體乙醇萃取物之定性分析………………………………….43
4.6 菌絲體粗萃取物清除自由基之能力測定……………………….45
4.7 多醣分析法…………………………………………...…………..46
4.8 光學顯微鏡觀察……………………………………………….…47
4.9 統計方法………………………………………………………….47
第五章 實驗結果
5.1培養基添加萃取物對菌絲體生長之影響………….…………….48
5.1.1 添加萃取液劑量之研究………...…………………...………48
5.1.2 五種樟屬植物水萃取物對牛樟芝生長之影響……………..54
5.1.3 樟樹之牛樟芝生長因子探討（一）…………………….……62
5.1.4 樟樹之牛樟芝生長因子探討（二）………………………….66
5.1.5 樟樹之牛樟芝生長因子探討（三）…………………………70
5.1.6 樟樹之牛樟芝生長因子探討（四）………………………….73
5.1.7 樟樹之牛樟芝生長因子探討（五）…………………………76
5.1.8 菌絲體生長之型態觀察……………………………………..80
5.2 樟樹多醣分離部之組成分析…………………………………….84
5.3 添加樟樹萃取物對菌絲體抗氧化力之影響---捕捉1,1-二苯基-2-
苦味肼基團（DPPH）之能力測定…………………….………..88
5.4 牛樟芝成分之定性分析………….………………………….…...99
5.5 培養條件對牛樟芝菌絲體蛋白質表現之影響………..…….…120
第六章 討論……………………………………………………………131
第七章 結論……………………………………………………………133
第八章 參考文獻....................................................................................135
表目錄
頁次
表5.1 樟樹多醣分離部經比對所得之單醣及其含量………….……...87
表5.2 不同培養條件下之菌絲體，其甲醇萃取物捕捉DPPH自由基
能力之影響………………………………………………………92
表5.3 樟樹水萃取液分離部培養之牛樟芝菌絲體，其甲醇萃取物捕捉
DPPH自由基能力之影響……………………………………….94
表5.4 樟樹水層分離部培養之牛樟芝菌絲體，其甲醇萃取物捕捉DPPH
自由基能力之影響…………………………………………........96
表5.5 樟樹多醣分離部培養之牛樟芝菌絲體，其甲醇萃取物捕捉DPPH
自由基能力之影響…………………………………….……..….98
圖目錄
頁次
圖2.1 牛樟芝子實體外表型……………………………………………..3
圖2.2 牛樟芝顯微鏡下觀察圖………………………………….…….…5
圖2.3 牛樟芝子實體中Ergostane 型化合物………….………….…….9
圖2.4 牛樟芝子實體中Lanostane型化合物………….………….……10
圖2.5 牛樟芝子實體化合物…………………………………………….11
圖2.6牛樟芝子實體之氧化型三萜類化合物……..………..……..……12
圖4.1 實驗流程及測定項目………………………………………….....24
圖4.2 生長因子追踪步驟……………………………………………….29
圖4.3 Fluorescein diacetate反應機制…………………………...………35
圖4.4 二維電泳操作流程圖…………………………………..…….…..38
圖4.5 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)之化學結構…………...….45
圖5.1 冇樟水萃取液對牛樟芝生長之影響…………………..………...50
圖5.2 冇樟水萃取液對牛樟芝代謝力之影響…………………..……...51
圖5.3 冇樟水萃取液對菌絲體蛋白質含量之影響…………………….52
圖5.4 冇樟水萃取液對菌絲體對總碳水化合物含量之影響……….…53
圖5.5 五種樟屬植物水萃取液對菌絲體乾重之影響………………….56
圖5.6 五種樟屬植物水萃取液對菌絲體生長代謝力之影響……….…57
圖5.7 五種樟屬植物水萃取液對菌絲體蛋白質含量之影響……….…58
圖5.8 五種樟屬植物水萃取液對菌絲體總碳水化合物含量之影響….59
圖5.9 五種樟屬植物水萃取液對菌絲體多醣產率之影響…………….60
圖5.10 五種樟屬植物萃取液培養之菌絲體外表型…………………...61
圖5.11 不同溶媒萃取物對菌絲體乾重之影響………………………...63
圖5.12 不同溶媒萃取物對菌絲體生長代謝力之影響………………...64
圖5.13 不同溶媒萃取物培養之菌絲體外表型………………………...65
圖5.14 牛樟芝菌絲體之產量與培養天數之關係……………………...67
圖5.15 牛樟芝菌絲體之生長代謝力與培養天數之關係……………...68
圖5.16 不同培養天數之牛樟芝菌絲體成長變化……………………...69
圖5.17 添加樟樹水萃取液分離部對菌絲體乾重之影響……………...71
圖5.18 添加樟樹水萃取物分離部對菌絲體生長代謝力之影響……...72
圖5.19 添加樟樹水層分離部對菌絲體乾重之影響…………………...74
圖5.20 添加樟樹水層分離部對菌絲體生長代謝力之影響…………...75
圖5.21 樟樹多醣分離部對菌絲體乾重之影響………………………...78
圖5.22 樟樹多醣分離部對菌絲體生長代謝力之影響………………...79
圖5.23不同培養基之牛樟芝菌絲體顯微圖（400x）………………....…82
圖5.24 牛樟芝不同培養基之菌絲體外觀圖…………………………...83
圖5.25 樟樹多醣高效陰離子交換層析圖……………………………...85
圖5.26 高效陰離子單醣比對分析圖…………………………………...86
圖5.27 不同培養條件下之菌絲體，其甲醇萃取物捕捉DPPH自由基能力之影響………………………………………………………..91
圖5.28 添加樟樹水萃取物分離部所培養之菌絲體，其甲醇萃取物捕捉
DPPH自由基能力之影響………………………………….…..93
圖5.29 樟樹水層分離部所培養之菌絲體，其甲醇萃取物捕捉DPPH自
由基能力之影響………………………………...……………...95
圖5.30 樟樹多醣分離部所培養之菌絲體，其甲醇萃取物捕捉DPPH自
由基能力之影響…………………….………………………….97
圖5.31 牛樟芝子實體乙醇萃取物HPLC分析圖…………………..…102
圖5.32 牛樟水萃取液所培養之菌絲體，其乙醇萃取物HPLC分析圖
…………………………………………………………………103
圖5.33 冇樟水萃取液所培養之菌絲體，其乙醇萃取物HPLC分析圖
…………………………………………………………………104
圖5.34樟樹水萃取液所培養之菌絲體，其乙醇萃取物HPLC分析圖
…………………………………………………………………105
圖5.35 土肉桂水萃取液所培養之菌絲體，其乙醇萃取物HPLC分析圖
…………………………………………………………………106
圖5.36 蘭嶼肉桂水萃取液所培養之菌絲體，其乙醇萃取物HPLC分析
圖.………………………………………………….…………107
圖5.37 以基礎培養基培養7天之牛樟芝菌絲體，其乙醇萃取物之
HPLC分析圖…………………………………….…………..108
圖5.38 以基礎培養基培養14天之牛樟芝菌絲體，其乙醇萃取物之
HPLC分析圖……………………………………….………..109
圖5.39 以基礎培養基培養21天之牛樟芝菌絲體，其乙醇萃取物之
HPLC分析圖………………………………………….……..110
圖5.40 以基礎培養基培養28天之牛樟芝菌絲體，其乙醇萃取物之
HPLC分析圖…………………………………………….…..111
圖5.41 添加樟樹水萃取液培養7天之牛樟芝菌絲體，其乙醇萃取物之
HPLC分析圖………………………………………….……..112
圖5.42 添加樟樹水萃取液培養14天之牛樟芝菌絲體，其乙醇萃取物
之HPLC分析圖………………………………………………113
圖5.43 添加樟樹水萃取液培養21天之牛樟芝菌絲體，其乙醇萃取物
之HPLC分析圖………………………………………………114
圖5.44 添加樟樹水萃取液培養28天之牛樟芝菌絲體，其乙醇萃取物
之HPLC分析圖………………………………………………115
圖5.45 固態培養19天之牛樟芝菌絲體，其乙醇萃取物之HPLC分析
圖………………………………………………………………116
圖5.46 牛樟木屑培養一個月之牛樟芝菌絲體，其乙醇萃取物之HPLC
分析圖…………………………………………………………117
圖5.47 樟樹木屑培養一個月之牛樟芝菌絲體，其乙醇萃取物之HPLC
分析圖…………………………………………………………118
圖5.48 樟樹水萃取液培養21天之牛樟芝菌絲體，其乙醇萃取物與
標準品比對之HPLC分析圖………………………………..119
圖5.49 固態培養19天牛樟芝菌絲體蛋白二維電泳圖……………..122
圖5.50 以基礎培養基培養14天之菌絲體，其蛋白二維電泳圖…..123
圖5.51 以基礎培養基培養21天之菌絲體，其蛋白二維電泳圖…..124
圖5.52 以基礎培養基培養28天之菌絲體，其蛋白二維電泳圖…..125
圖5.53 以樟樹水萃取液培養14天之菌絲體，其蛋白二維電泳圖..126
圖5.54 以樟樹水萃取液培養21天之菌絲體，其蛋白二維電泳圖..127
圖5.55 以樟樹水萃取液培養28天之菌絲體，其蛋白二維電泳圖..128
圖5.56 以樟樹水層分離部培養14天之菌絲體，其蛋白二維電泳圖…
…………………………………………………………………129
圖5.57 以樟樹多醣分離部培養14天之菌絲體，其蛋白二維電泳圖…
…………………………………………………………………130

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