臺灣博碩士論文加值系統

梅精為以5-6分熟之青梅為原料，榨汁、除渣後，經高度濃縮所得呈深黑色而粘稠性高之製品，一般認為具有增強免疫力等多種機能特性。本研究分為二個部份，第一部分為以傳統加熱濃縮的方式製作梅精，檢測製程中梅精品質之變化。梅精在加工過程中會產生mumefural，其含量隨加熱時間而增加而後再降低。第二部份為深入探討梅精的解毒機制，釐清於體內之影響，將藉由抗氧化酵素活性(superoxide dismutase; SOD)及調控藥物代謝之解毒酵素(包含phase I 系統的cytochrom P450 1A1、2E1、3A1及phase II系統的glutathione S-transferase; GST)之蛋白質與mRNA表現進行探討。以ICR小鼠餵食不同劑量梅精72小時後，發現餵食梅精0.5 g/kg時，SOD及CYP2E1具有較高的蛋白質表現量，劑量增高為1 g/kg及3 g/kg時，其蛋白質表現量有減少的趨勢；CYP1A1之mRNA在劑量為1 g/kg，而CYP3A1之mRNA在3 g/kg時，有顯著之增加。實驗結果發現，隨梅精劑量增加對GST 酵素活性的影響愈大，其蛋白質與mRNA表現量都會隨之提高；而在西方墨點法分析及RT-PCR 分析比較中，都可以發現CYP3A1及GST於mRNA會隨著劑量升高而表現量也增加之趨勢，因此我們推論梅精之代謝路徑乃經由cytochrome P450進行氧化還原及水解後，其代謝產物再經由GST結合由尿液或膽汁中排除以達到解毒之功效。

Commercial mei-gin is a highly concentrated and dark black product made from premature mei juice, it is generally recognized as the food with several function, such as immunity improvement. This study is divided into two parts, the first one was making mei-gin with traditional method of concentration the mei juice by heating, the quality changes of mei gin was detected during processing, the mumefural would be formed during processing and then decreased as the heating time was elongated. The second one is to study the detoxifying mechanism of the mei-gin, the antioxidant activation (superoxide dismutase; SOD) on the detoxifying enzyme of the metabolism of drug modulating (including cytochrom P450 1A1, 2E1, 3A1 of phase I system and glutathione S-transferase GST phase II) will be investigated, the protein expression and CYP2E1 tests showed higher protein expression at the feeding dosage of 0.5 g/kg for 72 hrs, and the protein expression was decreasing as the feeding dosage on 1 g/kg and 3 g/kg. The mRNA expression of CYP1A1 and CYP3A1 was increasing on the feeding dosage of 1 g/kg and 3 g/kg respectively. The protein expression of GST was increasing as the feeding dosage of mei-gin on 0.5 g/kg, so, it showed the detoxification of mei-gin on the dosage of 0.5 g/kg, and the detoxification was enhanced as the dosage of mei-gin on 1 g/kg and 3 g/kg. The protein expression and mRNA was increasing as the mei-gin dosage increased by the glutathione S-transterase of phaseⅡsystem. The mRNA expression of CYP3A1 and GST would increase as the mei-gin dosage increased by the RT-PCR analysis and western blotting analysis. It is proposed that the metabolic pathway of mei-gin is the oxido-reducted and hydrolyzed by cytochrome P450, the detoxification is due to the combination of its metabolin with GST and then egested by the urine or bile.

中文摘要………………..………………..…………………………… Ⅰ
Abstract………………..………………..……………………………..Ⅲ
謝誌………………..………………..………………………………… Ⅴ
目錄………………..………………..………………………………… Ⅵ
圖表目錄……………………………………………………………… Ⅹ
壹、前言………………..………………..……………………………. 1
貳、文獻回顧…………………………………………………………. 2
一、梅子…………………………………………………………… 2
（一）台灣梅子之簡介………………………………………… 2
（二）梅子果實之成分………………………………………… 2
（三）梅子之保健功效………………………………………… 5
二、梅精…………………………………………………………… 6
（一）梅精之介紹及製作流程………………………………… 6
（二）青梅汁之加工變化……………………………………… 7
（三）梅精之保健功效………………………………………… 12
三、肝癌簡介……………………………………………………… 14
（一）肝臟的構造與功能……………………………………… 14
（二）肝癌……………………………………………………… 14
（三）肝臟中藥物的代謝……………………………………… 15
1. 第一相（phase Ι）反應………………………………. 15
2. 第二相（phaseⅡ）反應……………………………… 18
參、材料與方法……………………………………………………….. 19
一、實驗架構……………………………………………………… 19
二、實驗材料……………………………………………………… 20
三、機器設備…………………………………………………….. 20
四、儀器設備……………………………………………………… 20
五、藥品名稱……………………………………………………… 21
六、實驗方法……………………………………………………… 22
第一部份：加工變化…………………………………………… 22
（一）青梅榨汁………………………………………………… 22
（二）梅精製作………………………………………………… 22
（三）一般成分測定…………………………………………… 22
1. 可溶性固形物測定……………………………………. 22
2. 酸度測定………………………………………………. 22
3. 水活性測定……………………………………………. 22
4. 水分含量測定…………………………………………. 23
5. 梅納反應………………………………………………. 23
6. Citric acid、Malic acid含量測定………………… 23
（1）樣品製備…………………………………………. 23
（2）Citric acid不同濃度標準液之配製……………… 23
（3）Malic acid不同濃度標準液之配製……………… 24
7. Mumefural、HMF 之測定……………………………... 24
（1）樣品製備…………………………………………. 24
（2）HMF不同濃度標準液之配製………………….... 25
（3） Mumefural不同濃度標準液之配製……………. . 26
8. DPPH自由基清除能力測定…………………………... 26
9. 統計分析………………………………………………. 27
第二部份：梅精之解毒機轉…………………………………… 28
（一）實驗動物………………………………………………… 28
（二） 西方墨點分析…………………………………………… 28
（三） RNA的萃取…………………..………………………… 29
（四）RT-PCR………………………………………………...... 29
（五）定量分析………………………………………………… 30
第三部份：細胞及動物實驗…………………………………… 31
（一）細胞實驗………………………………………………… 31
1. 細胞培養……………………………………………….. 31
2. HepG2細胞存活率分析……………………………….. 31
3. U937與HL60細胞存活率分析……………………….. 31
（二）動物實驗………………………………………………… 32
1.供試動物及購入時週齡………………………………... 32
2.馴化時間………………………………………………... 32
3.投與供試物開始週齡……………………………........ 32
4.飼育環境…………………………………………........ 32
5.動物的分組………………………………………........ 32
6.動物的個體標示…………………………………........ 33
7.飼料………………………………………………........ 33
8.飲水及飲水瓶……………………………………........ 33
9.人類肝癌細胞………………………………………....... 33
10.人類肝癌模式動物…………………………………..... 33
(1)死亡率………………………………………………... 33
(2)腫瘤大小測定………………………………………... 34
(3)拍照剖檢……………………………………………... 34
肆、結果與討論………………………………………………………. 35
第一部份：加工變化………………………………………… 35
一、 加工過程中可溶性固形物與可滴定酸度變化……………... 35
二、加工過程中水活性與水分含量之變化…………….……….. 35
三、加工過程中加工過程中梅精於420 nm的吸收值變化……. 36
四、加工過程中Citric acid及Malic acid含量變化…………….. 36
五、加工過程中HMF含量變化 ……………………………….. 36
六、Citric acid、malic acid、HMF、mumefural變化之分析.36
七、加工過程中Mumefural含量變化…………………………… 43
八、不同加熱時間之梅精清除DPPH 自由基之能……………. 43
第二部份：梅精之解毒機轉………………………………… 49
一、SOD在梅精劑量為0.5、1.0、3.0 g/kg時之蛋白質量分析. 49
二、CYP 2E1在梅精劑量為0.5、1.0、3.0 g/kg時之蛋白質量析……49
三、GST在梅精劑量為0.5、1.0、3.0 g/kg時之蛋白質量分析 49
四、CYP 1A1在梅精劑量為0.5、1.0、3.0 g/kg時之mRNA基因表現……49
五、CYP 3A1在梅精劑量為0.5、1.0、3.0 g/kg時之mRNA基因表現……49
六、GST在梅精劑量為0.5、1.0、3.0 g/kg時之mRNA基因表現……………49
第三部份：細胞及動物實驗………………… 57
一、不同濃度之梅精對血癌細胞U937細胞抑制率之影響........ 57
二、不同濃度之梅精對血癌細胞HL-60細胞抑制率之影響.…. 57
三、 不同濃度之梅精對肝癌細胞Hep G2細胞抑制率之影響.... 57
四、梅精治療人肝癌 (Smmu7721) 模式動物之效果評估......... 57
五、小鼠死亡率 57
六、梅精對肝癌細胞 (Smmu7721) 動物之腫瘤圖57
伍、結論………………………………………………………………. 63
參考文獻...................................... 64
作者簡介……………………………………………………………… 70

圖1、梅精製作過程中杏仁苷、苯甲醛、苯甲酸及氫酸之含量變化………9
圖2、mumefural 之結構…………………………………………… 13
圖3、PhaseⅠ與phase Ⅱ代謝關係圖……………………………… 16
圖4、P450酵素的氧化示意圖……………………………………… 17
圖5、加工過程中可溶性固形物與可滴定酸的化………………… 38
圖6、加工過程中水活性與水分含量的化………………………… 39
圖7、加工過程中梅精於420 nm的吸收值化………… 40
圖8、加工過程中Citric acid及Malic acid含量變化……………… 41
圖9、加工過程中HMF的含量之變化....... 42
圖10、加工過程中HMF與Mumefural含量變化之HPLC層析圖(280 nm)44
圖11、加工過程中HMF與Mumefural含量變化之HPLC層析圖(280 nm)45
圖12、加工過程中Mumefural的含量之變化……………… 46
圖13、SOD在梅精劑量為0.5、1.0、3.0 g/kg時之蛋白質量析…………51
圖14、CYP 2E1在梅精劑量為0.5、1.0、3.0 g/kg時之蛋白質量分析52
圖15、GST在梅精劑量為0.5、1.0、3.0 g/kg時之蛋白質量分析 53
圖16、CYP 1A在梅精劑量為0.5、1.0、3.0 g/kg時之mRNA基因表現量 54
圖17、CYP 3A1在梅精劑量為0.5、1.0、3.0 g/kg時之mRNA基因量……55
圖18、GST在梅精劑量為0.5、1.0、3.0 g/kg時之mRNA基因表現量…56
圖19、不同濃度之梅精對血癌細胞U937細胞抑制率之影響…...... 58
圖20、不同濃度之梅精對血癌細胞HL-60細胞抑制率之影響……. 59
圖21、不同濃度之梅精對肝癌細胞Hep G2細胞抑制率之影響...... 60
圖22、梅精對肝癌細胞（Smmu7721）之效果評估………………… 61
圖23、不同劑量之梅精抑制肝癌腫瘤之作用………………………. 62
表1、梅子果實之化學成分…………………………………………. 4
表2、新鮮梅汁與梅精中游離胺基酸與糖及糖醇之量………......... 8
表3、青梅汁濃縮至體積為二十分之ㄧ時，苯甲酸及苯甲醛之含量…… 11
表4、加工過程中可溶性固形物與可滴定酸度變化……………… 37
表5、Citric acid、Malic acid、HMF、Mumefural之檢量線…47
表6、不同加熱時間之梅精清除DPPH 自由基之能力之比較........ 48

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