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研究生:蔡薇薇
研究生(外文):Wei-Wei Tsai
論文名稱:牛樟芝2,3-丁二醇脫氫酶之基因選殖、蛋白質表現及酵素特性分析
論文名稱(外文):Gene cloning, expression and characterization of 2,3-butanediol dehydrogenase from Taiwanofungus camphorata
指導教授:林棋財
指導教授(外文):Chi-Tsai Lin
學位類別:碩士
校院名稱:國立臺灣海洋大學
系所名稱:生物科技研究所
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2012
畢業學年度:100
語文別:中文
論文頁數:66
中文關鍵詞:23-丁二醇脫氫酶23-丁二醇乙醯甲基甲醇
外文關鍵詞:23-butanediol dehydrogenase23-butanediolacetoin
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本論文為從牛樟芝(Taiwanofungus camphorata)子實體中選殖出 2,3-丁二醇脫氫酶(2,3-butanediol dehydrogenase ; Bdh, E.C. 1.1.1.4) cDNA,全長 1395 個鹼基對,轉譯區為 1219 個鹼基對,可轉譯出408個胺基酸,其預測分子量大小為 49.3 KDa,命名為牛樟芝 2,3-丁二醇脫氫酶 ( TcBdh ) 。2,3-Bdh利用NAD(P)H作為輔因子提供電子催化將乙醯甲基甲醇 (acetoin)還原成2, 3-丁二醇 (2,3-Bd),屬於中鏈脫氫酶家族,此胺基酸序列與其他物種的2,3-Bdh之間具有高度保留性,皆具有GXGXXG序列。
以pET-20b(+)做為表現載體,轉型至大腸桿菌 C43 (DE3)宿主與S. cerevisiae中進行表現帶有His6-taq的重組蛋白質,以Ni Sepharose TM 6 Fast Flow 親和性管柱進行純化。再以acetoin測其活性,並分析TcBdh之酵素特性。
最後,從酵素動力學分析得到,TcBdh對acetoin的KM值為8.46 mM,Vmax為0.02 mM/min ,kcat 為55 min-1。觀察2,3-Bdh之基本特性,於45℃之半衰期為5.3 min ;處在不同pH值的環境下發現,2,3-Bdh在pH 6下具有較高的活性。


The purpose of this thesis is to study NAD(P)H-dependent 2,3-butanediol dehydrogenase (2,3-Bdh) from Taiwanofungus camphorata , a medium chain dehydrogenase/reductase (MDR) is the main enzyme catalyzing the reduction of acetoin to 2,3-butanediol. It contains an open reading frame of 1219 bp which encodes a protein of 408 amino acid , molecular mass is 49.3 kDa and has the highly conserved GXGXXG sequence found in the MDR family and residues found in the coenzyme-binding pocket. To characterize the 2,3-Bdh , the coding region of Bdh was introduced into an expression vector pET-20b(+), and transform into Escherichia coli C43 (DE3) and S. cerevisiae.
The purified enzyme showed two bands on 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The enzyme exhibited TcBdh activity via acetoin assay. The Michaelis constant (Km) values for acetoin was 8.46 mM. The enzyme has a half-life of 5.3 min at 45℃ with a thermal inactivation rate constant kd of 3.5 × 10-2 min-1. The enzyme was active in pH 6.

目錄
謝辭 I
摘要 II
Abstract III
縮寫表 IV
目錄 VI
壹、前言 1
一、 丁二醇生合成 (2,3-Bd biosynthesis pathway) 1
二、 牛樟芝丁二醇脫氫酶 (2,3-Butanediol dehydrogenase , 2,3-Bdh) 4
三、 牛樟芝 5
四、 研究動機 7
貳、實驗材料 8
一、材料 8
二、載體 8
三、宿主 8
四、培養基 9
五、套組 (kits) 10
六、標準品 10
七、儀器 11
八、實驗耗材 12
九、實驗藥品 12
十、引子 15
參、實驗方法 16
一、牛樟芝丁二醇脫氫酶基因之選殖 16
二、牛樟芝丁二醇脫氫酶基因之序列分析 20
三、牛樟芝丁二醇脫氫酶基因與表現載體之建構 20
四、牛樟芝丁二醇脫氫酶與表現載體pYEX-S1之建構 23
五、勝任細胞之製備 23
六、牛樟芝丁二醇脫氫酶重組蛋白質表現與純化 24
七、 利用聚丙烯醯胺膠體電泳進行蛋白質分析 27
八、 西方墨點轉漬 30
九、 牛樟芝丁二醇脫氫酶之活性測定 32
十、牛樟芝丁二醇脫氫酶基因之特性分析 33
肆、結果 35
一、牛樟芝丁二醇脫氫酶之基因選殖 35
二、樟芝丁二醇脫氫酶之3-D結構模擬 36
三、TcBdh的表現與純化 37
四、牛樟芝丁二醇脫氫酶之活性測定 39
五、牛樟芝丁二醇脫氫酶之酵素動力研究 40
六、牛樟芝丁二醇脫氫酶之特性分析 41
伍、討論 43
參考文獻 46
圖表 49
Appendix 61



廖怡珍,2006,樟芝 2-Cys peroxiredoxin 之基因選殖及其特性分析,國立臺灣海洋大學 生物科技研究所 碩士學位論文

謝尚諶,2008,靈芝表面移行行為之調控及其宿主間之交互關係:-SspA,新的脂蛋白調控靈芝表面移行系統-2,3-butanediol緩解大鼠模式中脂多醣誘發之急性發炎反應,國立臺灣大學 醫學院醫學檢驗暨生物技術學研究所 博士學位論文

張志榮,2009,細菌代謝物 2,3-丁二醇 抑制肝癌形成且活化自然殺手細胞,長庚大學 醫學生物技術研究所 碩士學位論文

莊淑如,2009,改造具立體選擇性之酯水解酵素活化中心結構以改變其受質專一性,國立成功大學 生物科技研究所 碩士學位論文

Delves, P.J., and Roitt, I.M. (2000). The immune system. First of two parts. The New England journal of medicine 343, 37-49.

Ehsani, M., Fernandez, M.R., Biosca, J.A., and Dequin, S. (2009). Reversal of coenzyme specificity of 2,3-butanediol dehydrogenase from Saccharomyces cerevisae and in vivo functional analysis. Biotechnology and bioengineering 104, 381-389.

Gonzalez, E., Fernandez, M.R., Larroy, C., Sola, L., Pericas, M.A., Pares, X., and Biosca, J.A. (2000). Characterization of a (2R,3R)-2,3-butanediol dehydrogenase as the Saccharomyces cerevisiae YAL060W gene product. Disruption and induction of the gene. The Journal of biological chemistry 275, 35876-35885.

Gonzalez, E., Fernandez, M.R., Marco, D., Calam, E., Sumoy, L., Pares, X., Dequin, S., and Biosca, J.A. (2010). Role of Saccharomyces cerevisiae oxidoreductases Bdh1p and Ara1p in the metabolism of acetoin and 2,3-butanediol. Applied and environmental microbiology 76, 670-679.

Jones, D.T., and Woods, D.R. (1986). Acetone-butanol fermentation revisited. Microbiological reviews 50, 484-524.

Jornvall, H., Danielsson, O., Eklund, H., Hjelmqvist, L., Hoog, J.O., Pares, X., and Shafqat, J. (1993). Enzyme and isozyme developments within the medium-chain alcohol dehydrogenase family. Adv Exp Med Biol 328, 533-544.

Li, L., Wang, Y., Zhang, L., Ma, C., Wang, A., Tao, F., and Xu, P. (2012). Biocatalytic production of (2S,3S)-2,3-butanediol from diacetyl using whole cells of engineered Escherichia coli. Bioresource technology 115, 111-116.

Nicholson, W.L. (2008). The Bacillus subtilis ydjL (bdhA) gene encodes acetoin reductase/2,3-butanediol dehydrogenase. Applied and environmental microbiology 74, 6832-6838.

Nielsen, D.R., Yoon, S.H., Yuan, C.J., and Prather, K.L.J. (2010). Metabolic engineering of acetoin and meso-2,3-butanediol biosynthesis in E. coli. Biotechnol J 5, 274-284.

Nordling, E., Jornvall, H., and Persson, B. (2002). Medium-chain dehydrogenases/reductases (MDR). Family characterizations including genome comparisons and active site modeling. Eur J Biochem 269, 4267-4276.

Petrov, K., and Petrova, P. (2009). High production of 2,3-butanediol from glycerol by Klebsiella pneumoniae G31. Applied microbiology and biotechnology 84, 659-665.

Syu, M.J. (2001). Biological production of 2,3-butanediol. Applied microbiology and biotechnology 55, 10-18.

Xiao, Z.J., Qiao, S.L., Ma, C.Q., and Xu, P. (2010). Acetoin production associated with the increase of cell biomass in Bacillus pumilus ATCC 14884. Afr J Microbiol Res 4, 1997-2003.
Xu, H., Jia, S.R., and Liu, J.J. (2011). Development of a mutant strain of Bacillus subtilis showing enhanced production of acetoin. Afr J Biotechnol 10, 779-788.

Yu, B., Sun, J., Bommareddy, R.R., Song, L., and Zeng, A.P. (2011). Novel (2R,3R)-2,3-butanediol dehydrogenase from potential industrial strain Paenibacillus polymyxa ATCC 12321. Applied and environmental microbiology 77, 4230-4233.

Zhang, G.L., Wang, C.W., and Li, C. (2012). Cloning, expression and characterization of meso-2,3-butanediol dehydrogenase from Klebsiella pneumoniae. Biotechnology letters.


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