臺灣博碩士論文加值系統

樟芝（Antrodia camphorata）是台灣特有且極為昂貴的藥用真菌，近年來已有多份研究報告指出樟芝具有提升免疫機能、抑制腫瘤細胞的功能。樟芝液態培養乃目前主要的培養方式，可在短時間、有限空間下生產大量樟芝菌絲體，極具有商業經濟發展能力。

本研究以樟芝液態發酵培養菌絲並利用化學萃取方式，萃取大量的(1→3)-β-D-glucan。實驗先以BCRC 35396、35398、及35716等三株菌（皆購自食工所），比較各菌株測試結果實驗菌株以BCRC 35398所得結果較佳，其發酵液所產孢外多醣可為1.01 mg/mL、菌絲體乾重1.95 mg/mL、細胞數6.22×105 #/mL、(1→3)-β-D-glucan 0.29 mg/mL。分別使用層析儀與染色法所得BCRC 35398之高分子區域之MW：1,425,633的高分子醣類占總醣中的比例為3.1％。化學萃取程序所純化之(1→3)-β-D-glucan為凝膠結構，經過適當的處理後能夠清楚的分辨(1→3)-β-D-glucan各個碳的化學位移，C-1：為103.140 ppm、C-3：為86.250 ppm、C-5：為76.415 ppm、C-2：為72.930 ppm、C-4：為68.490 ppm、C-6：為60.958 ppm。

Antrodia camphorata is a peculiar and extremely expensive medical fungi in Taiwan. Recent studies on these fungi shown to have various biological activities including modulation of immune response and inhibition of tumor growth. Now submerged cultures can produce a large number of mycelium under short time and limited space, so it is still the major mode to culture and have commercial economic development ability very much. In this study, we used submerged cultivation to produce the mycelium, and its extraction and chemical purification from the different strains i.e. BCRC 35396, BCRC 35398 and BCRC 35716 of A. camphorata. The results indicated that the strain BCRC 35398 is better than the others where the extracellular polysaccharides concentration is 1.01 mg/mL, mycelium dry weight is 1.95 mg/mL, cell number is 6.2×105 and the (1→3)-β-D-glucan is 0.29 mg/mL, respectively. Although, the BCRC 35398 strain is better than the others, however, BCRC 35398’s (1→3)-β-D-glucan transform rate is better. We found that the BCRC 35398 produced extracellular polysaccharide has molecular weight is 1,425,633 and the percentage is 3.1 % in total carbohydrate by using gel filtration chromatography and dyeing method. Through the chemical extraction method, we found that (1→3)-β-D-glucan is the curdlan. In the 13C-NMR spectra, the chemical shift values of (1→3)-β-D-glucan were as follows: C-1 at 103.140 ppm, C-2 at 76.415 ppm, C-3 at 86.250 ppm, C-4 at 68.490 ppm, C-5 at 76.415 ppm and C-6 at 60.958 ppm, respectively.

目錄

摘要……………………………………………………………….……Ⅰ
Abstract…………………………………………………………….……Ⅱ
誌謝…………………………………………………………………..…Ⅲ
目錄………………………………………………………………..……Ⅴ
表目錄………………………………………………………………..…Ⅷ
圖目錄……………………………………………………………..……Ⅸ

壹、 樟芝文獻回顧
1-1 樟芝的分類與型態……………………...……………………1
1-2 樟芝的生理活性…………………………………………...…5
1-3 (1→3)-β-D-glucan
1-3-1 (1→3)-β-D-glucan的抗腫瘤活性………………...………8
1-3-2 (1→3)-β-D-glucan的特性………...….……………….…10
1-4 (1→3)-β-D-glucan的萃取方式….…………………………14
1-5 研究範圍與目的…………………………………………….19

貳、材料與方法
2-1-1 實驗材料與設備…………………………………….....…20
2-1-2 菌種來源及菌種保存……………..…………………...…20
2-1-3 前培養………………………………………………….…21
2-1-4 主培養………………………………………………….…21
2-2多醣純化之材料與方法
2-1 前言……………………………………………...………..…22
2-2 材料與設備……………………………………………….…22
2-2-1 發酵液粗多醣萃取………….………………………….…23
2-2-2 菌絲粗多醣萃取…………………………….………….…23
2-2-3 粗多醣純化……………………………………………..…24
2-2-4 多醣純化與製備……………………………………..……24
2-3多醣之分析
2-3-1 酚-硫酸法測定總醣…………………..….…………….…25
2-3-2 苯胺藍（aniline blue）螢光染色……………….……….…26
2-4 多醣體之層析法………………….….………………....……30
2-4-1實驗材料與儀器………………………………….…..........32
2-4-2 Gel Filtration Chromatography分析………….………...…32
2-4-3 HPLC-ELSD 分析……………………………………..….33
2-5 核磁共振光譜（Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer）分析………………………………..…………34
参、結果與討論
3-1 菌種篩選……………..………………….………………..…35
3-2 分子量的分布….…………..……………….…….…………40
3-3 多醣體的萃取純化…………………..…….……………..…47
3-4 NMR鑑定純化產物…………………………………………54

肆、結論與未來展望……………………………………………..…58
參考文獻……………………………………………………...…….…66
附錄…………………………………………………………...……..…73
作者簡歷………………………………………………………………80










表目錄

表一、近兩年樟芝研究報告之整理…………………………………..…7
表二、不同菌種之比較表………………………………………………39
表三、不同菌種發酵液（1→3）-β-D-glucan含量………………….…39
表四、利用苯胺藍染色法鑑定不同溶劑的萃取率……………………44
表五、利用苯胺藍染色法鑑定不同萃取時間的萃取率………………49
表六、利用苯胺藍染色法鑑定萃取次數萃取率………………………50
表七、利用苯胺藍染色法鑑定熱水萃取的萃取率與
所得樣品之重量………………………………..………………50
表八、不同萃取方式所獲得之產物量…………………………………53
表九、不同萃取方式所獲得之產物量的(1→3)-β-D-glucan濃度.…53
表十、整理文獻所得高分子多醣體之化學位移位置…………………57







圖目錄

圖一、樟芝子實體………………………………………………………..3
圖二、樟芝液態發酵之孢子…………………………………..…………4
圖三、裂褶菌多醣代表性的結構圖………………….…..…….………12
圖四、（1→6）branched（1→3）-β-D-glucan結構式……………….….13
圖五、酵母細胞壁假設圖………………………….…...………………15
圖六、菌絲體萃取步驟概要……………………………………………18
圖七、Sirofluor結構…………………………………….…...………….27
圖八、大小排除層析管柱的校正曲線…………………….…………..31
圖九、酚-硫酸法標準曲線……………………………………...………37
圖十、苯胺藍（aniline blue）螢光染色法標準曲線…………………….38
圖十一、膠體過濾層析不同分子量的標準品polymer standards
（MW：323,000/940,000/1,310,000/2,260,000）的分子
量標準曲線………………………………………………..…42
圖十二、BCRC 35398樟芝液態發酵液膠體過濾層析圖譜（GFC）....43
圖十三、膠體過濾層析分子量（MW：1,310,000）標準品 polymer standards的高分子濃度標準曲線（HPLC-ELSD）……….…44
圖十四、BCRC 35398液態發酵液濃度之HPLC-ELSD層析圖譜…45

圖十五、BCRC 35398樟芝液態發酵液膠體過濾層析圖譜(HPLC-ELSD)……………………………………………..…46
圖十六、使用0.5 M NaOH萃取酒精沉澱法萃取後之產物的氫譜
（200 MHz, DMSO）…………………..………….…..……....51
圖十七、不同萃取方式的步驟…………………………………………52
圖十八、(1→3)-β-D-glucan標準品之 13C NMR圖譜
（200 MHz, DMSO）…………………………………..…..….60
圖十九、熱水萃取後的產物B之 13C NMR圖譜（200 MHz, DMSO）.61
圖二十、熱水萃取後產物B經過酸水解處理之13C NMR圖譜
（200 MHz, DMSO）…………...……...………...…………....62
圖二十一、熱水萃取後產物B經過酸水解處理之1H NMR圖譜
（500 MHz, DMSO）…………...……...………...…………....63
圖二十二、熱水萃取後產物B經過酸水解處理之13C NMR圖譜
（500 MHz, DMSO）…………...……...………...…………....64
圖二十三、熱水萃取後產物B經過酸水解處理之HSQC圖譜
（500 MHz, DMSO）…………...……...………...…………....65

捌、參考文獻

水野 卓、川合正允著，賴慶亮譯 (1992) 菇類的化學•生化學。國立編譯館，台北。

李炫璋 （2003） 牛樟菌絲體之體內保肝功能評估及其熱水萃取物在體外對基質金屬蛋白水解酶活性之影響。中興大學食品科學研究所碩士論文，台中。

李貞宜 （2005) 樟芝保肝作用之探討。南台科技大學生物科技系碩士論文，台南。

江仟琦 （2005） 利用氣舉式發酵槽生產具有抑制肝癌及子宮頸癌細胞生長之樟芝發酵液。台灣大學食品科技研究所碩士論文，台北公館。

行政院國家科學委員會精密儀器發展中心，「儀器總覽」，國立編譯館，台灣。

官振儀 （1998） 利用酒槽水於靈芝液態培養之研究。東海大學化學工程學系碩士論文，台中沙鹿。

林苡芬 （2004） 不同發酵碳源之牛樟芝菌絲體發酵過濾液對人類肝癌細胞株之影響。台灣大學食品科技研究所碩士論文，台北公館。

高曉薇 （1991） 台灣靈芝屬新種樟芝之三萜類成份研究。台北醫學院天然物醫學研究所碩士論文，台北。

程一華 （1994） 樟芝之成份研究。台灣師範大學化學研究所碩士論文，台北公館。

陳宏文 （2001） 以回應曲面法探討樟芝高密度發酵並分析相關的成分與機能性。交通大學生物技術研究所碩士論文，新竹市。

陳心慧 （2003） 牛樟芝不同極性區分保肝機能性之研究。中山醫學大學營養科學研究所碩士論文，台中市。

陳正憲 （2006） 樟芝清除香菸萃取液之自由基及抑制平滑肌系胞氧化傷害。朝陽科技大學應用化學所碩士論文，台中霧峰。

陳佳鈺 （2005） 固態栽培樟芝防治癌症之重要機轉－癌症逆轉。台北醫學大學生物醫學材料研究所碩士論文，台北市 。

陳思瑋 （2005） 不同培養時間生產之樟芝發酵液對癌細胞生長之影響。，台灣大學食品科技研究所碩士論文，台北公館。

黃惟敏 （2000） 樟芝微量成分的研究（Ⅱ）。靜宜大學應用化學系碩士論文，台中沙鹿。

黃鈴娟 （2000） 樟芝與姬松茸芝抗氧化性質及其多醣組成分析。中興大學食品科學系碩士論文，台中市。

楊書威 （1990） 中藥樟菇活性成分之研究。台灣大學藥學研究所碩士論文，台北公館。

張怡婷 （2004） 樟芝抗腫瘤活性之研究。成功大學藥理學研究所碩士論文，台南。

張毅偉（2003） 靈芝中具有β-（1→6）分支之(1→3)-β-D-聚葡萄糖的性質與檢測。台灣大學食品科技研究所博士論文，台北公館。

吳建文 （2005） 利用動物細胞監測發酵培養的樟芝之生物活性。清華大學生物資訊與結構生物研究所碩士論文，新竹市。

蔡育真 （2005） 固態發酵樟芝對小鼠免疫調節及抗腫瘤。南台科技大學生物技術系碩士論文，台南。

蔡雁暉 （2002） 樟之深層培養義及其多醣體之抗氧化特性。中興大學食品科學系研究所碩士論文，台中市。

鄭懿芳 （2005） 樟芝菌絲體培養之胞外多醣體應用於抗老化化妝品成分之研究。嘉南藥理科技大學生物科技研究所碩士論文，嘉義。

蔣雅慧 （2005) 添加物對樟芝菌絲與抗氧化活性生成之影響。東海大學化學工程學系碩士論文，台中沙鹿。

謝曉環 （2003） 由麵包酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）純化β-（1,3）/（1,6）-glucan之研究。高雄應用科技大學化學工程系碩士論文，高雄。

Berit, H. F., Terje, E., Liv, R. and Bjørn, T. S. (2000) The cytokine stimulating activity of (1→3)-β-D-glucan is dependent on the triple helix conformation. Carbohydrate Research, Vol. 329, pp.587-596.

Bohn, J. A. and Bemiller, J. N. (1995) (1→3)-β-D-glucans biological response modifiers: a review of structure-functional activity relationships. Carbohydrate Polym, Vol.28, pp.3-14.

Buler, M. A., Catley, B. J. and Kelly, P. J. (1987) The effect of ammonium ions and pH on the elaboration of the fungal extracellular polysaccharide pullan, by Aureobasidium pullulans. Applied Microbiology and Biotechnol, Vol.25, pp.362-365.

Czop, J. K. and Austen, K. F. (1985) A beta-glucan inhibitable receptor on human monocytes: its identity with the phagocytic receptor for particulate activators of the alternative complement pathway. Journal of Immunol, Vol.134, pp. 2588-2593.

Eo, S. K., Kim, Y. S., Lee, C. K. and Han, S. S. (2000) Possible mode of antiviral activity of acidif of acidic protein bound polysaccharide isolated from Ganderma lucidum on herpes simplex viruses. Journal of Ethnopharmacol, Vol. 72, No. 3, pp475-481.

Januse, M. J., Austen, K. F. and Cozp, J. K. (1989) Isolation of a yeast heptaglucoside that inhibits monocyte phagocytosis of zymosan particles. Journal of Immunol, Vol. 142, pp.959-965.

Kishida, E., Sone, Y., and Misaki, A. (1992) Effect of branch distribution and chemical modification of antitumor (1→3)-β-D-glucan. Carbohydr. Res. Vol. 17, pp.85-95.

Kazuto, Y., Akio, T. and Naotake, N. (2003) Static Water Structure Detected by Heat Capacity Measurements on Aqueous Solutions of a Triple-Helical Polysaccharide Schizophyllan. Biomacromolecules,
Vol.4,pp1348-1356.

Lieu, C. W., Lee, S. S. and Wang, Y. (1992) The effect Ganderma lucidum on induction of differentation in leukemin U937 cells. Anticancer Research, Vol.12, pp.1211-1216.

Maruyama, H., Yamazaki, K., Murofushi, S., Konda C. and Ikekawa, T. (1989) Antiumor activity of Sarcodon aspratus (Berk) S. Ito and Ganoderma licidum (Fr.) Karst. Journal of Pharmacobio-Dyn, Vol.12, pp.118-123.

Farkas, V. (1979) Biosynthesis of Cell Walls of Fungi. Journal of Microbiological Reviews, Vol.43, No. 4, pp.117-144.

Stefan, F., Martin S., Othmar Ka¨ppeli and Hans, D. (2003) A new non-
degrading isolation process for 1,3-β-D-glucan of high purity from baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae. Carbohydrate Polym, Vol.54, pp.159-171.

Stone, B. A., Evan, N. A., Bonig, I., and Clarke, A. E. （1984）The application of sirofluor, a chem.ically defined fluorochrome from aniline blue for the histochemical detection of callose. Protoplasma, Vol.122, pp.191-195.

Szabo T, Kadish J. L. and Czop J. K. (1995) Biochemical properties of the ligandand-binding 20-kDa Subunit of the -Glucan Receptors on Human Mononuclear Phagocytes. Journal of Biological Chemistry, Vol. 270, pp.2145-2151.

Holler, S. W., “Fundamentals of analytical chemistry”

Sonda, T. S., Kain, R. J. and Yao, H. (2002) Physiochemical Properties of Polysaccharides Extracted from Tofu Processing Wastewater. Journal of Food chemistry and Toxicology,Vol.67, No. 5, pp.16821687.

Wasser, S.S. (2002) Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immuneomodulating polysaccharides. Appl Microbiol biotechnol, Vol.60, pp.258-274.

Young, S. H. and Jacobs, R. R. （1998）Sodium hydroxide-induced conformational change in Schizophyllan detected by the fluorescence dye, aniline blue. Carbohydrate Research, Vol.310, pp.91-99.